淫羊藿苷調控mTOR/Akt/CREB通路對高糖誘導的足細胞自噬及凋亡的影響*

李明霞,楊謙,喬海霞,王曉玲,賈麗媛,胡利梅,任衛東

(1.河北北方學院附屬第一醫院內分泌科,張家口 075000;2.河北北方學院,張家口 075000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者常見的微血管并發癥之一,其特點是一系列異常病理改變,包括腎小球肥大、系膜增生、腎小球基底膜增厚和細胞外基質積聚[1-2]。足細胞是腎小球毛細血管過濾的重要組成部分之一,越來越多的證據表明,由足細胞的異常凋亡與自噬受阻引起的細胞損傷與DN的發生和進展有關[3]。因此,研究足細胞的損傷對于揭示DN的發生和發展具有重要的指導意義。淫羊藿苷是淫羊藿提取物,屬黃酮類化合物,可用于治療腎病。淫羊藿苷可通過減輕大鼠炎癥反應、氧化應激水平,減少細胞外基質的增生并抑制腎組織細胞的凋亡來發揮對DN大鼠腎功能的保護作用[4];哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,Akt)/環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element binding protein,CREB)通路的激活可抑制細胞凋亡、促進自噬,從而發揮對粘菌素誘導的神經毒性的拮抗作用[5]。但淫羊藿苷能否通過調控mTOR/Akt/CREB通路來影響足細胞損傷介導的DN發生尚不可知,因此,本研究通過構建高糖誘導足細胞損傷模型,以探討淫羊藿苷對高糖狀態下足細胞自噬、凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞來源 小鼠足細胞MPC5購自上海酶研生物科技有限公司,批號:C20527。

1.2主要藥物、試劑與儀器 淫羊藿苷購自北京百靈威科技有限公司(原料藥,含量≥98%,貨號:CL417-30-5);mTOR抑制劑購自上海金穗生物科技有限公司(GDC-0349,貨號:CAL-6317);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,貨號JT1167K)、RPMI 1640培養基(貨號:JT2912K)、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT,貨號:JT3612K)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(貨號:JT50073)均購自鄭州金圖生物科技有限公司;吖啶橙(貨號:JPS0907)、細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC,貨號:JP19125)、電化學發光(electrochemiluminescence,ECL)試劑盒(貨號:JP70134)均購自碧云天生物科技有限公司;兔抗鼠微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)II(貨號:ab10651)、LC3Ⅰ(貨號:ab10659)、自噬相關蛋白(Beclin-1,貨號:ab10653)、B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)相關X蛋白(Bax)(貨號:ab20637)、Bcl-2(貨號:ab20640)、磷酸化mTOR(p-mTOR,貨號:ab36711)、磷酸化Akt(p-Akt,貨號:ab36814)、磷酸化CREB(p-CREB,貨號:ab39521)、mTOR(貨號:ab36712)、Akt(貨號:ab36817)、CREB(貨號:ab39524)、GAPDH(貨號:ab19174)一抗,羊抗兔二抗(貨號:ab05237)均購自美國Abcam公司;酶標儀(型號:DR3506)、凝膠成像儀(型號:EL-4900)均購自上海書俊儀器設備有限公司;熒光顯微鏡(型號:800TFL)、流式細胞儀(型號:FC800)均購自上海益鳴生物技術有限公司。

1.3細胞培養與分組 將MPC5細胞置于含有10% FBS、10 U·mL-1重組小鼠干擾素(interferon,IFN)-γ的RPMI 1640培養基中,在33 ℃、5%二氧化碳(CO2)和相對濕度95%下進行常規傳代培養。為了刺激細胞分化,將傳代后的MPC5細胞在含有10% FBS且不含小鼠IFN-γ的RPMI 1640培養基中,在37 ℃、5% CO2下培養14 d,使其分化成熟并達到80%～90%的融合,用于后續實驗。

依據參考文獻設計濃度,將MPC5細胞分為5組:正常對照組(5.5 mmol·L-1葡萄糖)[6]、高糖組(30 mmol·L-1葡萄糖)[6]、淫羊藿苷組(30 mmol·L-1葡萄糖+5 μmol·L-1淫羊藿苷)[7]、GDC-0349組(30 mmol·L-1葡萄糖+50 μmol·L-1GDC-0349)[8]、淫羊藿苷+GDC-0349組(30 mmol·L-1葡萄糖+5 μmol·L-1淫羊藿苷+50 μmol·L-1GDC-0349)。各組按上述濃度要求向RPMI 1640培養基中添加相應試劑或者藥物,培養48 h后,用于后續實驗。每組設置6個復孔。

1.4MTT法檢測MPC5細胞活力 將MPC5細胞以每孔1×104個接種到96孔板中,按照“1.3節”中的分組分別處理48 h后,將MTT溶液20 μL添加到每個孔中,并在37 ℃下再孵育4 h。使用酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度(A570),計算細胞活力(細胞活力=各處理組A570/正常對照組A570×100%)。

1.5吖啶橙染色觀察MPC5細胞的自噬情況 收集“1.3節”中處理48 h的5組MPC5細胞,取等量各組MPC5細胞分別轉移至含6 μg·mL-1吖啶橙的無血清RPMI 1640培養基中培養30 min,收集細胞,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)洗3次,利用熒光顯微鏡觀察各組MPC5細胞的自噬情況。

1.6流式細胞術檢測MPC5細胞凋亡 收集上述“1.3節”中處理48 h的5組MPC5細胞,按照每孔4×105個的濃度接種到6孔培養板中,用預冷PBS洗滌細胞15 min后將細胞重懸于500 μL結合緩沖液中。然后向每孔中加入Annexin V-FITC和碘化丙啶各5 μL,室溫下避光孵育15 min,利用流式細胞術分析MPC5細胞凋亡情況。

1.7蛋白印跡法檢測MPC5細胞自噬(LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1)及凋亡(Bax、Bcl-2)和mTOR/Akt/CREB通路相關蛋白的表達 將5組MPC5細胞用PBS洗滌2次后,在含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中裂解,裂解物以10 000 r·min-1(r=8 cm)、4 ℃離心15 min,收集上清液。BCA試劑盒用于測量蛋白質濃度,通過凝膠電泳分離等量的蛋白質后,將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上,將膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后,分別加入一抗抗體LC3Ⅱ(1：1 000)、LC3Ⅰ(1：1 000)、Beclin-1(1：1 000)、Bax(1：2 000)、Bcl-2(1：2 000)、p-mTOR(1：2 000)、p-Akt(1：1 000)、p-CREB(1：1 000)、mTOR(1：2 000)、Akt(1：1 000)、CREB(1：1 000)、GAPDH(1：2 000)4 ℃下孵育過夜,次日,用TBST洗滌3次,然后與羊抗兔二抗(1：2 000)在室溫下孵育1 h。通過ECL化學發光試劑盒對蛋白條帶的顯色情況進行檢測,以ImageJ軟件對蛋白質的表達進行定量。

2 結果

2.15組MPC5細胞活力比較 與正常對照組比較,高糖組MPC5細胞活力顯著降低(q=29.204,P<0.05);與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細胞活力顯著升高(q=19.641,P<0.05),GDC-0349組MPC5細胞活力顯著降低(q=7.769,P<0.05);與淫羊藿苷組比較,GDC-0349組、淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細胞活力顯著降低(q=27.410,P<0.05);與GDC-0349組比較,淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細胞活力顯著升高(q=8.132,P<0.05);見表1。

表1 5組MPC5細胞活力比較

2.25組MPC5細胞吖啶橙染色比較 正常對照組MPC5細胞自噬體呈現出正常的亮綠色熒光;與正常對照組比較,高糖組MPC5細胞自噬能力增強,自噬體表現出橙色熒光;與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細胞自噬能力進一步增強,自噬體數量增多,自噬體呈現出磚紅色熒光,GDC-0349組MPC5細胞自噬能力減弱,自噬體數量減少,自噬體表現出橙色熒光;與淫羊藿苷組比較,GDC-0349組、淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細胞自噬能力減弱,自噬體數量減少,自噬體表現出橙色熒光;與GDC-0349組比較,淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細胞自噬能力增強,自噬體表現出橙色熒光。見圖1。

圖1 吖啶橙染色檢測MPC5細胞自噬(×200)

2.35組MPC5細胞凋亡率比較 與正常對照組比較,高糖組MPC5細胞凋亡率顯著升高(q=11.436,P<0.05);與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細胞凋亡率顯著降低(q=8.899,P<0.05),GDC-0349組MPC5細胞凋亡率顯著升高(q=6.713,P<0.05);與淫羊藿苷組比較,GDC-0349組、淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細胞凋亡率顯著升高(q=15.611、7.599,P<0.05);與GDC-0349組比較,淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細胞凋亡率顯著降低(q=8.012,P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 流式細胞術檢測MPC5細胞凋亡

表2 5組MPC5細胞凋亡率比較

2.45組MPC5細胞自噬(LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1)、凋亡(Bax、Bcl-2)相關蛋白表達比較 與正常對照組比較,高糖組MPC5細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax蛋白表達水平顯著升高,Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(q=6.480～23.307,P<0.05);與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達水平顯著升高,Bax蛋白的表達水平顯著降低(q=6.465～13.162,P<0.05),GDC-0349組MPC5細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低,Bax蛋白表達水平顯著升高(q=5.758～12.930,P<0.05);與淫羊藿苷組比較,GDC-0349組、淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低,Bax蛋白表達水平顯著升高(q=6.263～18.239,P<0.05);與GDC-0349組比較,淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達水平顯著升高,Bax蛋白表達水平顯著降低(q=5.888～13.132,P<0.05)。見圖3和表3。

A.正常對照組;B.高糖組;C.淫羊藿苷組;D.GDC-0349組;E.淫羊藿苷+GDC-0349組。

表3 5組MPC5細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較

2.55組MPC5細胞mTOR/Akt/CREB通路相關蛋白表達比較 與正常對照組比較,高糖組MPC5細胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白的表達水平顯著降低(q=7.034～11.068,P<0.05);與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達水平顯著升高(q=5.336～6.008,P<0.05),GDC-0349組MPC5細胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達水平顯著降低(q=8.246～11.700,P<0.05);與淫羊藿苷組比較,GDC-0349組、淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達水平顯著降低(q=4.608～17.709,P<0.05);與GDC-0349組比較,淫羊藿苷+GDC-0349組MPC5細胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達水平顯著升高(q=8.974～10.752,P<0.05);見表4和圖4。

A.正常對照組;B.高糖組;C.淫羊藿苷組;D.GDC-0349組;E.淫羊藿苷+GDC-0349組。

表4 5組MPC5細胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達水平比較

3 討論

DN的臨床特征表現為持續性蛋白尿升高、腎小球基底膜增厚和細胞外基質聚集,導致自噬流抑制、足細胞損傷進而促進腎功能障礙[9-10]。然而,足細胞損傷介導的DN的發病機制仍不清楚,并且缺乏DN的治療策略。研究表明,足細胞自噬主要負責蛋白質和細胞器降解,調節細胞穩態,其功能障礙是足細胞損傷的重要誘導因素[11];短時間內的高糖處理可誘導足細胞自噬,而隨著葡萄糖干預時間的延長,自噬水平降低[12];DN中足細胞的增殖和再生是有限的,其異常凋亡與DN的發生和進展有關[13-14]。本研究結果顯示,與正常對照組比較,高糖組MPC5細胞活力降低,自噬體數量增加,細胞凋亡率升高,自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1及促凋亡蛋白Bax表達水平升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低,提示高糖組MPC5細胞自噬及凋亡能力增強,表明高糖誘導的足細胞損傷模型構建成功。

淫羊藿苷具有保護神經元免受損傷、改善骨質疏松、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁、抗氧化等多種生物活性[15]。張穎等[16]發現淫羊藿苷能改善DN大鼠腎動脈舒縮功能。WANG等[17]報道淫羊藿苷可減輕高糖誘導的DN大鼠和腎小球系膜細胞的氧化應激,抑制細胞外基質的產生。MI等[18]報道淫羊藿苷通過抑制細胞凋亡和激活自噬來預防骨關節炎的發生。但淫羊藿苷對高糖誘導的MPC5細胞自噬及凋亡的影響筆者尚未見報道。本研究結果顯示,與高糖組比較,淫羊藿苷組MPC5細胞活力升高,自噬體數量增加,細胞凋亡率降低,自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1及抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平升高,促凋亡蛋白Bax表達水平降低,提示淫羊藿苷可促進高糖誘導的MPC5細胞自噬并抑制細胞凋亡,減輕細胞損傷。

mTOR信號通路是一條經典的調控自噬凋亡信號通路,在細胞代謝中發揮重要作用[19]。研究表明,mTOR在多條信號通路中位于核心位置,其可通過激活下游Akt/CREB通路發揮神經保護作用[5,20]。ZHANG等[21]研究表明,激活Akt/CREB通路可防止高糖誘導的神經毒性;OU等[22]研究顯示,激活Akt/CREB通路可防止氧化低密度脂蛋白誘導的人內皮細胞氧化損傷。本研究結果顯示,高糖組MPC5細胞p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達水平均低于正常對照組,表明mTOR/Akt/CREB通路在高糖條件下處于抑制狀態。而淫羊藿苷組MPC5細胞中p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB蛋白表達水平顯著高于高糖組,推測淫羊藿苷可能通過激活mTOR/Akt/CREB通路促進高糖誘導的足細胞自噬及抑制細胞凋亡。為了驗證該推測,本研究設置mTOR/Akt/CREB通路抑制劑GDC-0349進行干預,結果顯示,與高糖組和淫羊藿苷組比較,GDC-0349組MPC5細胞活力降低,自噬體數量減少,細胞凋亡率升高,促凋亡蛋白Bax表達水平升高,自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1及抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低,表明GDC-0349抑制mTOR/Akt/CREB通路后,可加重高糖誘導的MPC5細胞損傷。而淫羊藿苷+GDC-0349可逆轉淫羊藿苷對高糖誘導MPC5細胞的作用效果,進一步證明了淫羊藿苷通過激活mTOR/Akt/CREB通路促進高糖誘導的MPC5細胞自噬,抑制細胞凋亡,進而減輕細胞損傷。

綜上所述,淫羊藿苷可促進高糖誘導的MPC5細胞自噬,抑制細胞凋亡,該機制與激活mTOR/Akt/CREB通路有關。但關于淫羊藿苷調控高糖誘導的MPC5細胞自噬及凋亡的作用機制較多,有待進一步研究。