青錢柳多糖調(diào)節(jié)胰島和肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4轉(zhuǎn)位干預(yù)2型糖尿病大鼠的作用機(jī)制*

劉海云,石淼婷,駱欣怡,孫敏燕,徐晨曦,陳鯤翰,王曉敏,舒任庚

(江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,南昌 330004)

2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)是一種嚴(yán)重影響人類健康、以高血糖和胰島素抵抗為特征的慢性代謝性疾病[1]。胰島β細(xì)胞的功能受損和胰島素抵抗是T2DM重要病理生理過程。青錢柳廣泛分布我國(guó)的江西、湖北、湖南等省,是我國(guó)特有的單種屬植物[2]。近年來國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)公布青錢柳葉為新資源食品。青錢柳葉具有良好的改善糖脂代謝紊亂等作用而引起更多的關(guān)注。青錢柳葉中含有豐富的多糖、黃酮、皂苷等多種次生代謝產(chǎn)物[3-4],其中青錢柳多糖[Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja polysaccharide,CPP]具有良好的降血糖和降血脂等藥理作用[5-6]。研究表明,CPP主要通過促進(jìn)葡萄糖利用、保護(hù)胰島細(xì)胞、調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路等多種途徑糾正糖脂代謝紊亂[7],但其對(duì)于調(diào)節(jié)血糖關(guān)鍵環(huán)節(jié)——葡萄糖攝取的機(jī)制尚不清楚。本課題組前期研究結(jié)果表明,CPP顯著上調(diào)骨骼肌胰島素受體底物1(insulin receptor substrates 1 ,IRS-1)、磷酯酰肌醇3 激酶(phosphorylated phosphoinositide-3-kinase,PI3K )、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶1(phosphorylated serine-threonine kinase 1,Akt1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4 ,GLUT4)mRNA表達(dá)水平[8]。GLUT4是細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的重要載體蛋白,在胰島素刺激下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)GLUT4的囊泡移動(dòng)到細(xì)胞膜上,與葡萄糖結(jié)合,促進(jìn)葡萄糖攝取來調(diào)節(jié)血糖?；贑PP對(duì)胰島抵抗重要器官——胰島和肝臟的影響尚不清楚,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察其對(duì)肝臟和胰島PI3K、Akt1、GLUT4蛋白表達(dá)及GLUT4轉(zhuǎn)位的影響,為CPP防治2型糖尿病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物 取青錢柳茶葉(湖南省張家界高山怡韻茶葉有限公司,由江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張壽文教授鑒定)5 kg,熱水提取之后,得到青錢柳水提物。將水提物經(jīng)過濾、濃縮與醇沉后過濾去除殘?jiān)?得到濾液,再將濾液減壓濃縮至2 L,加入4倍體積的無水乙醇,使其含醇量達(dá)80%,放4 ℃靜置過夜。以2 250×g轉(zhuǎn)速將醇沉過濾液離心15 min,得到多糖沉淀物,再將多糖沉淀物依次用無水乙醇、丙酮及乙醚洗滌并干燥,即得CPP粗品[9]。

1.2動(dòng)物 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)雄性SD大鼠,4周齡,體質(zhì)量(180±20) g,購買于湖南斯萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2021-0004,動(dòng)物合格證號(hào):01754718,動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號(hào):JZLLSC2021-0065。于江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng),晝夜各12 h,飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃。

1.3試劑 鏈脲佐菌素(美國(guó)Simga公司,批號(hào):S0130);血糖儀試紙條(瑞士羅氏活力公司,批號(hào):0514418);總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白( low density lipoprotein,LDL)(中生北控生物科技股份有限公司,批號(hào):20210724、20210307、20210227、20210120);膽固醇、膽酸鈉(美國(guó)BBI公司,批號(hào):D421BA0028、E305BA0043);蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司,批號(hào):717112);p-PI3K、p-Akt1、GLUT4一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,批號(hào):bs-6417R、bs-60670R、bs-0384R);SP二步法試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB )顯色盒(北京中杉金橋生物試劑公司,批號(hào):ZS-1619、ZS-154、PV-9001和K133319D);免疫熒光試劑(武漢賽維爾生物公司,批號(hào):GB22303)。

1.4儀器 高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Simga公司,SIGMA3-18K);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司,SpectraMaxM3);電熱恒溫水浴鍋(濟(jì)南東吉儀器有限公司,HH.S21-4);紫外分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司,UV-2102型);切片機(jī)、烤片機(jī)(德國(guó)徠卡公司,EG1150H、RM2255);顯微鏡(德國(guó)徠卡公司,DM2500);全自動(dòng)數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)(美國(guó)羅氏公司,iScan Coreo);Image J(美國(guó)冷泉公司)。

1.5方法

1.5.1造模、分組及給藥 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,給予高脂高糖乳劑灌胃,劑量1 mL·kg-1,連續(xù)灌胃8周后,禁食12 h,腹腔1次性注射鏈脲佐菌素35 mg·kg-1,72 h后取內(nèi)眥靜脈血測(cè)其空腹血糖值,血糖>11.1 mmol·L-1大鼠則為造模成功[10]。大鼠隨機(jī)分為5組,即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、CPP小劑量組、CPP大劑量組、二甲雙胍組,每組9只。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組均灌胃給予0.9%氯化鈉溶液1 mL·kg-1;CPP小劑量組給予CPP 5 g·kg-1;CPP大劑量組給予CPP 10 g· kg-1;二甲雙胍組給予鹽酸二甲雙胍0.25 g·kg-1,均灌胃給予,體積均為1 mL·kg-1,灌胃8周。

1.5.2大鼠的一般情況及體質(zhì)量變化 觀察各組大鼠的行為學(xué)改變、活動(dòng)度、皮膚毛發(fā)、飲食、飲水情況等一般狀況;分別于實(shí)驗(yàn)前和每周末稱取大鼠體質(zhì)量各1次,連續(xù)8周。

1.5.3血糖和血脂測(cè)定 待大鼠禁食12 h后,予10%水合氯醛麻醉眼球取血,靜置30 min,2 250×g轉(zhuǎn)速離心20 min,吸取血清,測(cè)定空腹血糖值和TC、TG、LDL、HDL含量,嚴(yán)格參照說明書操作。

1.5.4HE染色法觀察肝臟和胰島病理形態(tài)的改變 切取胰腺的胰尾部分和肝左葉,用甲醛固定后,石蠟包埋切片,進(jìn)行常規(guī)HE染色,觀察胰島和肝臟組織學(xué)變化,嚴(yán)格參照說明書操作。

1.5.5免疫組化法檢測(cè)胰島p-PI3K、p-Akt1和GLUT4表達(dá) 將胰腺石蠟切片,厚度約3 μm。60 ℃烘烤2 h,待蠟融化后趁熱放入二甲苯、梯度乙醇進(jìn)行透明和脫水,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saling,PBS)清洗后,加入3%過氧化氫(H2O2)在室溫下孵育,放入高壓鍋進(jìn)行熱修復(fù)抗原5 min。滴加p-PI3K、p-Akt1、GLUT4抗體分別按照1：300、1：200、1：200比例稀釋,正常對(duì)照組滴加PBS。4 ℃過夜,DAB顯色,在光鏡下觀察組織變?yōu)闇\棕色即停止反應(yīng)。全自動(dòng)數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)采集圖片,并選取200倍視野/張切片5個(gè),用Image Pro Plus 6.0版軟件進(jìn)行圖像分析。

1.5.6免疫熒光觀察GLUT4轉(zhuǎn)位 胰腺和肝臟組織石蠟切片脫蠟至水后,切片浸沒pH值6.0檸檬酸緩沖液中,放入微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原熱修復(fù),自然冷卻,用PBS緩沖液晃動(dòng)洗滌,切片稍甩干,加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min,流水沖洗10 min,滴加牛血清清蛋白(albumin from bovine serum,BSA)封閉孵育30 min,滴加1：200比例稀釋的GLUT4一抗后放入濕盒,4 ℃孵育過夜。連續(xù)3次PBS洗滌后,滴加二抗后,避光室溫孵育50 min,PBS晃動(dòng)洗滌,滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液避光室溫孵育10 min。連續(xù)3次,每次PBS晃動(dòng)洗滌5 min,抗熒光淬滅封片劑封片,并熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)位情況并采集圖像[11]。采用Image J軟件分析圖像,得出灰度值后,計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度值=給藥組平均強(qiáng)度/正常對(duì)照組平均強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠的基本狀態(tài)及體質(zhì)量情況 正常對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)期精神狀況良好,活動(dòng)敏銳,毛色光亮。模型對(duì)照組大鼠懶惰厭動(dòng),毛色發(fā)黃并易脫毛,消瘦,多食,多飲和多尿。CPP組和二甲雙胍組大鼠的“三多一少”癥狀有所改善。造模前各組間大鼠體質(zhì)量均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模成功后,與正常對(duì)照組比較,其余各組大鼠體質(zhì)量明顯升高(P<0.05)。給藥8周后,CPP大劑量組和二甲雙胍組大鼠的體質(zhì)量均有所增加,與模型對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果見表1。

表1 5組大鼠不同時(shí)間的體質(zhì)量變化

2.2各組大鼠空腹血糖測(cè)定結(jié)果 造模前各組間大鼠空腹血糖無明顯差異。造模后大鼠血糖明顯升高,與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給藥8周后,與模型對(duì)照組比較,CPP大劑量組和二甲雙胍組大鼠空腹血糖明顯下降(P<0.05)。CPP小劑量組大鼠空腹血糖雖下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果見表2。

表2 5組大鼠不同時(shí)間的空腹血糖

Tab.2 Fasting glucose in five groups of rats at different times

表2 5組大鼠不同時(shí)間的空腹血糖

組別造模前給藥前 給藥8周正常對(duì)照組5.5±0.74.8±0.7①4.7±0.6①模型對(duì)照組5.0±0.621.0±6.116.6±6.4二甲雙胍組4.8±0.618.0±7.17.6±3.2②CPP 小劑量組4.6±0.518.8±7.312.6±5.8 大劑量組4.9±0.820.3±7.49.8±4.4②

①與模型對(duì)照組比較 ,t=5.061、10.321,P<0.01;②與模型對(duì)照組比較 ,t=2.142、4.325,P<0.05。

①Compared with model control group,t=5.061,10.321,P<0.01;②Compared with model control group,t=2.142,4.325,P<0.05.

2.3各組大鼠血脂的測(cè)定結(jié)果 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組LDL升高,HDL下降(P<0.01),提示模型對(duì)照組大鼠的血脂紊亂。與模型對(duì)照組比較,CPP大、小劑量組和二甲雙胍組HDL升高(P<0.05),TC、TG和LDL有所下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且二甲雙胍的效果優(yōu)于CPP,提示CPP主要是提高HDL水平。見表3。

表3 5組大鼠血脂的測(cè)定結(jié)果

Tab.3 Determination of serum lipid in five groups of rats

表3 5組大鼠血脂的測(cè)定結(jié)果

組別TCTGLDLHDL正常對(duì)照組1.49±0.220.64±0.220.12±0.060.71±0.06模型對(duì)照組2.38±0.761.36±0.210.35±0.14①0.39±0.20①二甲雙胍組1.62±0.370.75±0.190.14±0.070.52±0.18②CPP 小劑量組1.77±0.120.91±0.600.26±0.190.57±0.23② 大劑量組2.23±0.410.88±0.910.30±0.060.55±0.25②

①與正常對(duì)照組比較,t=6.752、9.874,P<0.01;②與模型對(duì)照組比較, t=2.245～3.391,P<0.05。

①Compared with normal control group,t=6.752,9.874,P<0.01;②Compared with model control group,t=2.245-3.391,P<0.05.

2.4各組大鼠胰島和肝臟形態(tài)改變 正常對(duì)照組胰島細(xì)胞數(shù)量多,排列有序,呈橢圓形或圓形,邊界清晰。模型對(duì)照組大鼠的胰島受損,形狀不規(guī)則,邊界模糊,細(xì)胞排列紊亂,纖維組織增多,有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。CPP大、小劑量組與二甲雙胍組的胰島相對(duì)完整,形狀接近橢圓形,邊界相對(duì)清晰;細(xì)胞排列有序,僅有少數(shù)胰島細(xì)胞變性或壞死及少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

正常對(duì)照組大鼠肝小葉完整,肝細(xì)胞大小正常,細(xì)胞呈圓形,細(xì)胞核居中,以中央靜脈為中心呈放射狀。模型對(duì)照組大鼠有較多肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性,部分肝細(xì)胞出現(xiàn)核固縮。給藥組肝細(xì)胞脂肪變性明顯好轉(zhuǎn),肝小葉結(jié)構(gòu)較完整。見圖1。

A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.CPP小劑量組;D.CPP大劑量組;E.二甲雙胍組。

2.5各組大鼠胰島細(xì)胞p-PI3K、p-Akt1、GLUT4蛋白表達(dá) p-PI3K和p-Akt1免疫組織化學(xué)陽性表達(dá)均位于細(xì)胞質(zhì),GLUT4陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組胰島的p-PI3K、p-Akt1、GLUT4蛋白平均灰度值明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與模型對(duì)照組比較,CPP大劑量組和二甲雙胍組胰島p-PI3K和p-Akt1、GLUT4陽性表達(dá)明顯升高(P<0.05或P<0.01),提示CPP能提高胰島p-PI3K、p-Akt1、GLUT4蛋白表達(dá)。見圖2。

2.6各組大鼠胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞GLUT4移位 GLUT4熒光染色在胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜均表達(dá),顯示紅色熒光。GLUT4是細(xì)胞膜上一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,如細(xì)胞質(zhì)也有表達(dá),提示細(xì)胞質(zhì)的GLUT4囊泡可能向細(xì)胞膜發(fā)生轉(zhuǎn)位[11]。在模型對(duì)照組中,胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜GLUT4染色較少。與模型對(duì)照組比較,CPP給藥組的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的GLUT4熒光強(qiáng)度增加。這表明CPP可促進(jìn)胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞GLUT4囊泡向細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)位。見圖3。

3 討論

中醫(yī)“消渴”癥涵蓋糖尿病,病由熱生,熱極成毒,因而熱毒是“消渴病”重要病因。清熱解毒中藥對(duì)糖尿病具有療效好、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)[12]。青錢柳是我國(guó)特有的單種屬植物,其枝葉味甘甜,具有清熱消腫、鎮(zhèn)痛的功效,是一種能降血糖的茶葉。近年來多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)CPP具有良好的降低血糖、改善血脂作用[13-14]。機(jī)體葡萄糖和脂質(zhì)代謝的紊亂是引起胰島抵抗關(guān)鍵環(huán)節(jié)。彭曉娟等[15]的研究表明,CPP顯著減輕非酒精性脂肪性肝病/T2DM大鼠代謝紊亂、肝臟脂肪變性及炎癥反應(yīng),能夠抑制肝臟及脂肪組織過氧化物酶體增殖物激活受體-γ和增強(qiáng)子結(jié)合蛋白mRNA 的表達(dá)量,提示CPP可通過肝胰島素抵抗降低血糖。本課題組前期研究表明CPP具有降低血糖、胰島素水平和胰島素抗體的作用。本研究進(jìn)一步觀察其對(duì)肝臟和胰島形態(tài)影響及GLUT4轉(zhuǎn)位影響,結(jié)果表明,給予CPP 8周后,模型大鼠一般癥狀有所好轉(zhuǎn),血糖下降和HDL上升,且CPP大劑量組的胰島近似橢圓形,結(jié)構(gòu)較完整,邊界較清晰,炎癥細(xì)胞和纖維組織明顯減少,損傷的胰島有所修復(fù),且脂質(zhì)變性的肝細(xì)胞數(shù)量也明顯減少,進(jìn)一步提示CPP大劑量組具有良好的降血糖與降血脂藥理作用,能改善高脂和鏈脲佐菌素造成的肝臟和胰島損傷。本結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似[16]。

肝臟、骨骼肌和脂肪組織等外周胰島素抵抗是胰島素抵抗重要組成部分,胰島素通過與肝臟、骨骼肌等器官細(xì)胞膜胰島受體結(jié)合激活下游PI3K/Akt1促進(jìn)肝和肌肉等細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上促進(jìn)葡萄糖攝取。胰島素PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的缺失和異?？蓪?dǎo)致GLUT4的表達(dá)減少、易位受阻及含GLUT4囊泡不能與細(xì)胞膜融合、GLUT4活性降低等,導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[17]。

GLUT4是一種膜蛋白,主要在肝臟、骨骼肌和脂肪細(xì)胞表達(dá),主要儲(chǔ)藏在細(xì)胞內(nèi)囊泡,是外周組織轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的重要載體蛋白[18]。胰島素與肝臟、骨骼肌、脂肪等各種靶細(xì)胞膜胰島素受體相結(jié)合后,IRS磷酸化,激活下游PI3K/Akt1通路,促發(fā)GLUT4囊泡以胞吐形式向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)位,靶組織對(duì)葡萄糖攝取增加。研究表明PI3K既可通過肝臟、骨骼肌和胰島等組織細(xì)胞上調(diào)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4表達(dá)及轉(zhuǎn)位,同時(shí)也能夠激活下游線粒體的功能,調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的代謝和能量平衡[19]。因而PI3K是GLUT4轉(zhuǎn)位必需的信號(hào)分子之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,CPP組能夠升高T2MD大鼠胰島細(xì)胞p-PI3K、p-Akt1、GLUT4蛋白表達(dá)。免疫熒光結(jié)果可直觀觀察到模型對(duì)照組的胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞GLUT4免疫熒光強(qiáng)度明顯減弱,而CPP組胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜GLUT4熒光強(qiáng)度升高。該結(jié)果提示,CPP可能促進(jìn)肝臟和胰島細(xì)胞質(zhì)內(nèi)GLUT4向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位,且胰島p-PI3K、p-Akt1、GLUT4蛋白表達(dá)增多,提高肝細(xì)胞和胰島攝取葡萄糖,從而降低血糖水平。

綜上所述,本研究表明CPP具有降低T2MD模型大鼠血糖和升高HDL水平的藥理作用,減輕高糖對(duì)胰島和肝臟的損傷,其機(jī)制可能是通過上調(diào)胰島p-PI3K、p-Akt1、GLUT4含量,并促進(jìn)胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位。但是其以胰島和肝臟哪個(gè)為主導(dǎo),還是兩者的協(xié)同作用,有待進(jìn)一步深入研究。