LC-MS/MS定量檢測(cè)小鼠尿液RNA氧化標(biāo)志物8-oxoGsn

蔡玉瑩,殷繼明,高玉雪,楊鵬翔,關(guān)媛月,陳德喜△

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京 100069;2.北京肝病研究所,北京 100069

活性氧簇(ROS)作為機(jī)體各系統(tǒng)和器官中氧化還原反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物,其產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡,但當(dāng)機(jī)體受到有害因素刺激或處于病理狀態(tài)時(shí),ROS水平增加,體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡[1-2]。由于RNA分子大多是單鏈,修復(fù)機(jī)制不完整,更易受到氧化應(yīng)激的影響[3]。RNA氧化損傷與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4-11]。8-氧化鳥(niǎo)苷(8-oxoGsn)是常見(jiàn)的RNA氧化堿基,是公認(rèn)的定量氧化性RNA損傷的生物標(biāo)志物[12-15]。目前8-oxoGsn常用的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[16]、電化學(xué)法(ECD)[17]、氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)[18]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[19-20]。本研究建立了一種高靈敏度、高特異度的LC-MS/MS,用于定量檢測(cè)小鼠尿液中的8-oxoGsn,以期為人尿液中RNA氧化損傷標(biāo)志物檢測(cè)方法的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠、乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)基因(HBV-Tg)小鼠,5～9周齡,體質(zhì)量24～30 g,由北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司提供。所有小鼠嚴(yán)格遵守首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理和福利相關(guān)規(guī)定(倫理批件號(hào):AEEI-2021-257)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2儀器與試劑 Agilent 6495三重四極桿質(zhì)譜、Agilent 1290 型超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);Centrifuge 5425R 型高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);BSA224S 型微量電子天平(德國(guó)Sartorius公司);XMTD-6000電熱恒溫水浴鍋(中國(guó)長(zhǎng)風(fēng)公司);MS3 digital 型渦旋混勻儀(德國(guó) IKA公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q Advantage 純水儀(美國(guó) Millipore公司)制備的超純水(18.2 MΩ·cm);PB-10酸度計(jì)(德國(guó) Sartorius公司);8-oxoGsn、同位素內(nèi)標(biāo)(IS)[13C,15N2]8-oxoGsn(加拿大TRC公司);甲醇(色譜純,美國(guó)Thermo Fisher公司);甲酸、醋酸銨(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱(chēng)取8-oxoGsn標(biāo)準(zhǔn)品,用50%甲酸水溶解,配制成質(zhì)量濃度均為1 mg /mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液。用純水稀釋配制成7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液及低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控溶液,標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為0.5、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0、100.0 ng/mL。質(zhì)控濃度為2.5、12.5、100.0 ng/mL,IS濃度為100 ng/mL。

1.3.2色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBOX SB-Aq色譜柱(100 mm×3 mm,1.8 μm),流動(dòng)相A相為10 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.1%甲酸),B相為純甲醇;梯度洗脫程序(7 min):起始10%B,0～2 min 45%B;2～5 min 95%B;5～6 min 95%B維持;6～7 min 10%B,流速為0.3 mL/min,柱溫35 ℃,自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃,進(jìn)樣器體積為5 μL。

1.3.3質(zhì)譜條件 采用Agilent 6495三重四極桿質(zhì)譜,電噴霧電離(ESI)正離子模式, MRM, Nebulizer 20 psi,Gas Flow 14 L/min,Sheath Gas Temp 250 ℃,Sheath Gas Flow 11 L/min,Capillary 3 000 V,Nozzle Voltage 1 500 V。

1.3.4尿液樣本處理 將凍存的尿液在37 ℃下孵育5 min,使其完全解凍,4 ℃ 12 000×g離心5 min。取20 μL 尿液上清液加入180 μL 70%甲醇溶液[含70%甲醇和30% 10 mmol/L 醋酸銨(pH 3.7)的溶液]以獲得(1∶10)稀釋尿液。混勻后加入20 μL濃度為100 ng/mL的IS[13C,15N2]8-oxoGsn,渦旋混勻2 min,4 ℃ 12 000×g 10 min 離心,取100 μL上清液于內(nèi)襯管中用于LC-MS/MS分析。

1.3.5尿液樣本處理 本實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6小鼠、HBV-Tg小鼠兩組小鼠作為研究對(duì)象,共計(jì)20只小鼠參與實(shí)驗(yàn)。其中,C57小鼠分為兩組,每組5只,1組為對(duì)照組,另1組注射對(duì)乙酰氨基酚(APAP);HBV-Tg小鼠也分為兩組,每組5只,1組為對(duì)照組,另1組注射APAP。應(yīng)用建立的方法對(duì)小鼠尿液樣本中8-oxoGsn水平進(jìn)行測(cè)定,小鼠禁食12 h后,腹腔注射300 mg/kg的APAP,用于構(gòu)建C57小鼠和HBV-Tg小鼠的肝損傷模型,6 h后留取尿液。

隨著開(kāi)源軟件社區(qū)的迅速發(fā)展和開(kāi)源社區(qū)協(xié)作平臺(tái)的日益成熟，與傳統(tǒng)的軟件工程相比，開(kāi)源軟件開(kāi)發(fā)過(guò)程中形成了龐大的開(kāi)源社區(qū)存儲(chǔ)庫(kù)，這為我們通過(guò)軟件存儲(chǔ)庫(kù)數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)了解開(kāi)源軟件開(kāi)發(fā)過(guò)程和項(xiàng)目狀況提供了豐富的數(shù)據(jù)資源.本章采用的總體分析流程如圖2所示：

1.3.6質(zhì)譜條件優(yōu)化 使用1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,流速0.30 mL/min,對(duì)8-oxoGsn的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選擇ESI源,在MRM模式下對(duì)8-oxoGsn、[13C,15N2]8-oxoGsn的母離子、子離子及碰撞能量逐一優(yōu)化。

1.3.7色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)選用Agilent ZORBOX SB-Aq色譜柱(100 mm×3 mm,1.8 μm),對(duì)梯度和等度不同流動(dòng)相體系優(yōu)化。

1.3.8標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限 連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,在0.5～100.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)構(gòu)建7個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以8-oxoGsn與IS的峰面積比值(即響應(yīng))為縱坐標(biāo),以8-oxoGsn的濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)調(diào)整加權(quán)因子1/X或1/X2(X是分析物的濃度)分析校準(zhǔn)。

1.3.9樣品加標(biāo)回收率 合并3個(gè)小鼠尿液樣本混合均勻并分為兩組。在測(cè)定該樣品的同時(shí),取另一份加入2.5、12.5、100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行測(cè)定,每一濃度平行操作6份。加標(biāo)回收率計(jì)算方法為P=(加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值)/加標(biāo)量×100%。

1.3.10基質(zhì)效應(yīng) IS峰面積的相對(duì)變化歸因于基質(zhì)效應(yīng),反映了尿液基質(zhì)導(dǎo)致待測(cè)物提取損失和離子抑制。根據(jù)6份尿液樣品中IS的平均峰面積與6份水樣中標(biāo)準(zhǔn)品的平均峰面積之比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng),計(jì)算公式為(1-尿液中IS峰面積/水中IS峰面積)×100%。

1.3.11精密度 通過(guò)重復(fù)測(cè)定低、中、高濃度的3份尿液樣本中8-oxoGsn水平來(lái)確定精密度。每一樣本平行操作6份,1 d內(nèi)進(jìn)樣6次以獲得日內(nèi)檢測(cè)結(jié)果,3 d重復(fù)進(jìn)樣獲得日間檢測(cè)結(jié)果,并代入線性回歸方程計(jì)算濃度。精密度計(jì)算方法為變異系數(shù)(CV)=標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/計(jì)算結(jié)果的算術(shù)平均值(X)×100%。

1.3.12小鼠尿液樣本檢測(cè) 應(yīng)用建立的方法對(duì)小鼠尿液樣本中8-oxoGsn水平進(jìn)行測(cè)定,小鼠禁食12 h后,腹腔注射300 mg/kg的對(duì)APAP,用于構(gòu)建C57小鼠和HBV-Tg小鼠的肝損傷模型,6 h后留取尿液。

2 結(jié) 果

2.1.1質(zhì)譜條件優(yōu)化 在ESI正離子模式下,8-oxoGsn、[13C,15N2]8-oxoGsn都可以獲得強(qiáng)度較高的[M+H]-準(zhǔn)分子離子峰,在二級(jí)質(zhì)譜高碰撞能量下獲得豐度較高的子離子。8-oxoGsn以300.0 m/z為母離子,以167.8 m/z為子離子,這是核糖部分丟失,或與CO一起丟失所致,碰撞電壓為15 V;[13C,15N2]8-oxoGsn以303.0 m/z為母離子,以170.8 m/z為子離子,碰撞電壓為20 V。

2.1.2色譜條件優(yōu)化 流動(dòng)相A相為10 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.1%甲酸,pH 3.7),B相為純甲醇,采用梯度洗脫時(shí),檢測(cè)物的峰形良好,具有較高靈敏度,見(jiàn)圖1。醋酸銨的加入極大地提高了離子響應(yīng),本方法分析時(shí)間可以縮短到7 min。

注:A為甲醇-水溶液,B為甲醇-10 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.1%甲酸,pH=3.7)。

2.2方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限 在0.5～100.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)8-oxoGsn相對(duì)響應(yīng)和濃度的線性關(guān)系良好,線性方程為Y=0.008 442X+0.001 668,R2=0.996 8,最佳加權(quán)因子為1/X2。以信噪比S/N=3∶1時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度確定本方法的檢出限為0.25 ng/mL。見(jiàn)圖2。

圖2 8-oxoGsn的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2樣品加標(biāo)回收率 低、中、高濃度的加標(biāo)回收率分別為86.21%、112.56%、94.74%,滿足生物樣本的分析要求。

2.2.3基質(zhì)效應(yīng) 尿液基質(zhì)效應(yīng)為-5.01%。基質(zhì)效應(yīng)為負(fù)值,說(shuō)明被8-oxoGsn尿液基質(zhì)中離子增強(qiáng)。

2.2.4精密度 8-oxoGsn的日內(nèi)和日間CV分別為3.38%～7.17%、2.74%～9.52%,見(jiàn)表1。小鼠尿液樣品中8-oxoGsn的精密度良好。表1結(jié)果符合生物樣品測(cè)定要求,均在可接受范圍內(nèi)。

表1 小鼠尿液8-oxoGsn日內(nèi)和日間精密度

2.2.5小鼠尿液樣本檢測(cè) 用APAP處理后,C57小鼠APAP處理組8-oxoGsn水平[(51.44±2.18)ng/mL],明顯高于C57小鼠未處理組[(41.06±5.33)ng/mL](P<0.01);HBV-Tg小鼠APAP處理組8-oxoGsn水平[(78.63±12.05)ng/mL]明顯高于HBV-Tg小鼠未處理組[(45.34±3.70)ng/mL](P<0.001),見(jiàn)圖3。

注:C57小鼠未處理組與APAP處理組比較,**P<0.01;HBV-Tg小鼠未處理組與APAP處理組比較,***P<0.001。

3 討 論

本研究基于靶向LC-MS/MS建立了小鼠尿液8-oxoGsn水平的檢測(cè)方法,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。使用Agilent ZORBOX SB-Aq色譜柱,ESI離子源,流動(dòng)相中醋酸銨的加入,在正離子MRM模式下提高了離子化效率,改善了峰形。而過(guò)高的醋酸銨則會(huì)抑制目標(biāo)物的離子化且損傷液相系統(tǒng),前期實(shí)驗(yàn)表明10 mmol/L醋酸銨效果最佳。使用0.1%甲酸將液相pH調(diào)節(jié)至3.7,以抑制溶質(zhì)離子化,獲得對(duì)稱(chēng)的色譜峰。

已報(bào)道的LC-MS/MS大多使用固相萃取法[21],成本較高,前處理操作煩瑣,檢測(cè)時(shí)間17 min。本實(shí)驗(yàn)采用稀釋法,檢測(cè)時(shí)間只需7 min,簡(jiǎn)單快速,基質(zhì)效應(yīng)良好。前期實(shí)驗(yàn)筆者比對(duì)了5、10、20倍等不同的稀釋倍數(shù),結(jié)果顯示,樣本10倍稀釋時(shí)基質(zhì)影響較低,且有最好的信噪比。此外,筆者對(duì)于樣本處理時(shí)甲醇水的比例也進(jìn)行了驗(yàn)證,70%甲醇30% 10 mmol/L 醋酸銨(pH 3.7)的比例最合適,提高了分離選擇性,醋酸銨的存在可保持一定的離子強(qiáng)度,改善了8-oxoGsn峰形,減少了譜帶拖尾。圖1結(jié)果顯示,在樣本溶液中,8-oxoGsn及[13C,15N2]8-oxoGsn基線較穩(wěn)定,信噪比良好。由于尿液是內(nèi)源性物質(zhì)可能存在具有相似極性、質(zhì)量和斷裂模式的相關(guān)化合物,經(jīng)優(yōu)化后樣本中仍有與待測(cè)物相同的子母離子對(duì),但保留時(shí)間不同,且基線完全分離,不影響定量。

準(zhǔn)確定量8-oxoGsn對(duì)進(jìn)一步研究RNA氧化損傷具有重要意義。本研究采用LC-MS/MS檢測(cè)了小鼠尿液8-oxoGsn水平,結(jié)果顯示,正常的C57小鼠與HBV-Tg小鼠均有一定程度的氧化損傷,這符合AMES等[22]的研究結(jié)果,即生物體具備完善的氧化修復(fù)機(jī)制也會(huì)有少量的損傷的堿基,且因?yàn)榈貌坏匠浞值男迯?fù)而發(fā)生損傷的積累。正常的C57小鼠與HBV-Tg小鼠的8-oxoGsn水平無(wú)明顯差異,可能是因?yàn)镠BV-Tg小鼠為轉(zhuǎn)基因鼠,血清中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)呈陽(yáng)性但無(wú)HBV DNA復(fù)制,因此氧化損傷程度相似。而高濃度APAP處理后,C57與HBV-Tg小鼠相比于未處理組8-oxoGsn水平上升,這提示尿液中RNA氧化損傷的生物標(biāo)志物8-oxoGsn在臨床上將很可能被廣泛用于評(píng)估各種疾病的風(fēng)險(xiǎn)、診斷和預(yù)測(cè)治療效果。

本方法操作簡(jiǎn)單、分析速度快、靈敏度高,為進(jìn)一步研究各種疾病背景下RNA氧化損傷創(chuàng)造了條件,為人的尿液RNA損傷標(biāo)志物的檢測(cè)提供了方法參考。