乙型肝炎相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者組織NQO1表達(dá)水平對預(yù)后的影響

別立翰,趙 悅,何成山,吳 迪

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,上海 200137;2.同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院檢驗科,上海 200090

肝細(xì)胞癌(HCC)為我國常見惡性腫瘤,發(fā)病率居惡性腫瘤第5位,死亡率較高[1-2]。我國大部分原發(fā)性肝癌病因為乙型肝炎病毒(HBV)感染,80%以上HCC患者合并HBV感染,且具有隱匿性[3]。乙型肝炎相關(guān)性HCC(HBV-HCC)的特征為反復(fù)炎癥活動,流行病學(xué)顯示,反復(fù)炎癥的部位極易發(fā)生腫瘤[4],炎癥也被列為腫瘤的一大特征[5]。針對該腫瘤的治療方式在不斷進(jìn)步,但患者預(yù)后仍不佳。準(zhǔn)確評估HBV-HCC的預(yù)后對臨床治療方案選擇、盡早干預(yù)具有重要意義。醌氧化還原酶-1(NQO1)為同源二聚體黃素酶,底物為NADH或NADPH,能將醌直接還原為對苯二酚[6-7]。NQO1具有異源解毒、清除超氧物等功能，在保護(hù)正常細(xì)胞受到氧化損傷及癌變中發(fā)揮重要作用[8]。研究顯示，NQO1被破壞可增加惡性腫瘤發(fā)生風(fēng)險[9-10]。為此，本研究通過觀察NQO1在HBV-HCC組織中的表達(dá)情況，并分析其對預(yù)后的影響，旨在為臨床早期診療與預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年3月至2020年1月于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院行手術(shù)治療的103例HBV-HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn):符合《原發(fā)性肝癌診療指南(2022年版)》標(biāo)準(zhǔn)[11],且經(jīng)病理證實為HCC;血清HBV表面抗原(HBVsAg)呈陽性,合并HBV感染,但無丙型肝炎病毒感染;具有手術(shù)指征;知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤患者;既往肝癌手術(shù)史患者;合并其他病毒感染患者;伴有自身免疫性肝病患者;術(shù)前行放化療治療患者;臨床資料不完整患者。納入研究的患者中,男58例,女45例;年齡為25～72歲,平均(50.48±6.39)歲;美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)第8版分期[12]:Ⅰ期30例,Ⅱ期29例,Ⅲ期26例,Ⅳ期18例。本研究取得上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 術(shù)中取患者癌組織及癌旁組織,采用免疫組織化學(xué)染色法檢測NQO1表達(dá),方法如下。組織脫蠟、梯度乙醇入水。于75～85 ℃下用枸櫞酸抗原修復(fù)液處理20 min,室溫冷卻;3%過氧化氫處理,用磷酸鹽緩沖液PBS沖洗后加入一抗NQO1,在4 ℃下過夜。次日加入免疫組織化學(xué)兩步法檢測試劑盒中試劑,PBS沖洗后用DAB顯色,蘇木精復(fù)染,退水、透明、封固后在顯微鏡下觀察。為體現(xiàn)NQO1蛋白抗體免疫組織化學(xué)的特異性,選擇NQO1蛋白陽性切片作為陽性對照,用PBS替代一抗作為陰性對照。

1.3組織NQO1陽性標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化染色后待細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色、棕黃色顆粒為陽性,在顯微鏡下每張切片選擇5個200倍視野,計算陽性細(xì)胞占比。其中陽性細(xì)胞占比:<5%為陰性(-),5%～25%為弱陽性(+),>25%～50%為中等陽性(++),>50%～100%為強(qiáng)陽性(+++)。以陽性細(xì)胞占比>25%為高表達(dá),以陽性細(xì)胞占比≤25%為低表達(dá)[13]。

1.4隨訪 對患者行3年定期電話或門診隨訪,隨訪時間由手術(shù)后至死亡或最后一次隨訪,隨訪截止時間為2023年1月。總生存率為術(shù)后至死亡或隨訪截止時間內(nèi)的生存情況,無復(fù)發(fā)生存期為術(shù)后至影像學(xué)顯示復(fù)發(fā)時間內(nèi)無復(fù)發(fā)情況[14]。

2 結(jié) 果

2.1組織NQO1表達(dá)情況 NQO1在HBV-HCC組織中呈細(xì)胞質(zhì)染色模式,陽性率為84.47%(87/103),高表達(dá)率為59.22%(61/103);HBV-HCC組織中NQO1陽性率、高表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 NQO1在不同組織中的表達(dá)[n(%)]

注:左圖為癌旁組織,右圖為HBV-HCC組織。

2.2組織NQO1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 NQO1高表達(dá)與低表達(dá)患者性別、年齡、肝硬化方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),NQO1高表達(dá)與低表達(dá)患者腫瘤最大徑、病灶數(shù)量、AJCC分期、血管侵犯比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 組織NQO1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表2 組織NQO1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3組織NQO1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 3年隨訪結(jié)果顯示,患者中位生存時間為37個月,無失訪病例;103例患者死亡34例,總生存率為66.99%(69/103),復(fù)發(fā)42例,無復(fù)發(fā)生存率為59.23%(61/103)。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示,NQO1高表達(dá)組總生存率[52.46%(32/61)]與無復(fù)發(fā)生存率[50.82%(31/61)]低于NQO1低表達(dá)組[88.10%(37/42),71.43%(30/42)](P<0.05)。見圖2。

圖2 NQO1高表達(dá)與低表達(dá)患者的生存曲線

2.4影響患者預(yù)后的多因素分析 COX單因素結(jié)果顯示,腫瘤最大徑、病灶數(shù)量、AJCC分期、血管侵犯、NQO1與總生存率有關(guān)(P<0.05)。COX多因素結(jié)果顯示,NQO1高表達(dá)、腫瘤最大徑≥5 cm、病灶多發(fā)、AJCC分期為Ⅲ～Ⅳ期、血管侵犯是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。見表3。

3 討 論

我國是乙肝大國,為世界上乙肝負(fù)擔(dān)最重的國家之一[15]。HCC為發(fā)病及死亡率較高的惡性腫瘤,病情進(jìn)展快且治療困難,患者預(yù)后較差,成為威脅人們生命的公共衛(wèi)生問題[16]。HBV感染為該腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要因素,HBV感染后其DNA與宿主DNA整合產(chǎn)生基因產(chǎn)物,導(dǎo)致宿主基因組穩(wěn)定性喪失,染色體變異最終發(fā)展為HCC。目前該腫瘤治療方式包括手術(shù)、肝移植等,由于腫瘤早期發(fā)現(xiàn)率較低,總體治療效果不佳[17]。故早期準(zhǔn)確篩查HBV-HCC并及時評估患者預(yù)后對治療療效具有重要意義。

NQO1為重要的同型二聚體黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)酶,該酶對醌類與其代謝前體引發(fā)的致癌致突變、細(xì)胞毒性等有一定保護(hù)作用[18-19]。研究顯示,NQO1在腫瘤中表達(dá)上調(diào)與其在細(xì)胞癌變中發(fā)揮細(xì)胞防御功能有關(guān)[20]。本研究中,NQO1在HBV-HCC組織中高表達(dá)率為59.22%(61/103),高于癌旁組織,與傅瀟等[21]研究結(jié)果類似。該結(jié)果說明了NQO1在增殖細(xì)胞中表達(dá)較高,靜止或終末分化細(xì)胞中表達(dá)較低[22]。本研究結(jié)果顯示,NQO1表達(dá)與腫瘤最大徑、AJCC分期、血管侵犯、病灶數(shù)量有關(guān),說明NQO1表達(dá)與患者病理特征相關(guān),病情越嚴(yán)重其表達(dá)越高。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示,NQO1高表達(dá)組總生存率與無復(fù)發(fā)生存率均低于NQO1低表達(dá)組,提示NQO1表達(dá)情況與患者預(yù)后密切相關(guān)。COX單因素分析發(fā)現(xiàn),腫瘤最大徑、病灶數(shù)量、AJCC分期、血管侵犯、NQO1與總生存率有關(guān)。COX多因素分析顯示,NQO1高表達(dá)、腫瘤最大徑≥5 cm、病灶多發(fā)、AJCC分期為Ⅲ～Ⅳ期、血管侵犯是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。NQO1為機(jī)體中調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要因子,在腫瘤中的作用機(jī)制尚不明確。王維偉等[23]指出,NQO1與TP53抑癌基因穩(wěn)定性有關(guān),能保護(hù)其不受20S蛋白酶體降解,誘導(dǎo)致癌結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制細(xì)胞進(jìn)展為腫瘤細(xì)胞。NQO1的C609T基因多態(tài)性能減少肝細(xì)胞中p53表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡,而增加基因組不穩(wěn)定性,提高HCC的易感性[24]。

綜上所述,NQO1在HBV-HCC組織中表達(dá)上調(diào),與患者臨床病理特征有關(guān),可作為評估HBV-HCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。