外周血單個核細胞YY1、miR-181a-5p表達水平對妊娠期糖尿病不良妊娠結局的預測價值

劉海霞,王麗麗,魏小敏,楊玉俠,宋志慧

唐山市婦幼保健院產科,河北唐山 063000

妊娠期糖尿病(GDM)是一種涉及高血糖的代謝紊亂的疾病,定義為在懷孕期間首次發病或被識別為任何程度的碳水化合物不耐受的情況,影響全球9%～25%的妊娠期女性[1]。GDM為一種常見的產前疾病,可增加母親及其后代不良結局的風險,嚴重危害母嬰健康[2]。目前,GDM在臨床上多采用藥物治療、科學運動及合理飲食等方式來緩解,但效果不甚理想[3]。因此,尋求與GDM不良妊娠結局的相關因素,對其進行早期識別和干預,可有效改善妊娠結局[2]。YY1轉錄因子(YY1)為GLI-Kruppel家族鋅指DNA結合蛋白的成員,可通過調控轉錄、表觀遺傳、DNA修復、染色質重塑等過程來調節細胞增殖、死亡、分化和發育等[4]。在小鼠糖尿病實驗中發現,YY1失活可損害線粒體氧化磷酸化的活性,誘導小鼠模型中的線粒體功能障礙和糖尿病的發生[5]。微小RNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA,可以通過與其靶mRNA的3′-非翻譯區(3′UTR)部分結合來內源性地調節基因表達,從而參與細胞的各種生物過程[6]。據報道,高糖可誘導miR-181a-5p表達水平下調,miR-181a-5p過表達可能抑制高糖作用下腎小球系膜細胞增殖并促進細胞凋亡,使糖尿病腎病得到緩解[6]。然而,目前YY1、miR-181a-5p在GDM中的研究鮮見報道。本研究旨在探索YY1、miR-181a-5p在GDM患者外周血單個核細胞(PBMC)中的表達水平及其對不良妊娠結局的預測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2020年6月至2022年6月本院接收的GDM患者200例。納入標準:(1)首次確診為GDM[7],診斷標準為檢查前3 d正常飲食,空腹8 h、口服含75 g葡萄糖的液體(250～300 mL)1、2 h時采集靜脈血后測血清血糖水平,符合下列3項中的任意一項即診斷為GDM,空腹血糖≥5.1 mmol/L,口服葡萄糖耐量試驗后1 h血糖≥10.0 mmol/L或2 h血糖≥8.5 mmol/L;(2)活胎單胎妊娠;(3)年齡22～40歲;(4)未進入產程,可配合隨訪。排除標準:(1)機體重要臟器功能不全者;(2)有妊娠期心臟病、妊娠期高血壓等并發癥者;(3)入院前服用相關治療血脂、血糖藥物者;(4)有精神障礙者。選取同期產檢健康孕婦100例為對照組。GDM組平均年齡(28.03±6.39)歲;平均分娩孕周(33.86±7.82)周;平均孕前體質量指數(22.87±5.84)kg/m2;平均空腹血糖(7.24±2.28)mmol/L;初產婦110例(55.00%),經產婦90例(45.00%)。對照組平均年齡(27.98±5.66)歲;平均分娩孕周(33.48±7.39)周;平均孕前體質量指數(23.02±5.36)kg/m2;平均空腹血糖(3.82±0.83)mmol/L;初產婦53例(53.00%),經產婦47例(47.00%)。除空腹血糖外,GDM組與對照組的其他基本資料比較差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過本院倫理委員會批準,并得到所有參與者的知情許可。

1.2方法

1.2.1血液采集及PBMC制備 在孕婦入組時采集其空腹肘靜脈血5 mL,然后加入等體積磷酸鹽緩沖液(PBS,賽默飛世爾科技有限公司),混勻后加入裝有淋巴細胞分離液的離心管中,離心后收集白膜層細胞,使用PBS重新洗滌,然后采用Ficoll密度梯度離心法離心留取管底部的PBMC。將其-80 ℃保存,用于提取RNA。

1.2.2YY1、miR-181a-5p表達水平檢測 使用TRIzol總RNA抽提試劑盒(德國Qiagen公司)從PBMC中提取總RNA,紫外分光光度計測定RNA純度,使A260/A280為1.8～2.0,逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)轉錄合成cDNA。采用實時熒光定量PCR試劑盒(德國Qiagen公司)配制25.0 μL反應體系:SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 12.5 μL,正、反向引物各0.5 μL,cDNA模板2.5 μL,ddH2O 9.0 μL。混勻后在熒光定量PCR儀(美國ABI公司)中進行擴增,反應設置為95 ℃預變性2 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40個循環。根據美國國家生物技術信息中心(NCBI)相應的序列設計引物,引物序列見表1。反應結束后,以β-actin、U6為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算YY1、miR-181a-5p相對表達水平。

1.3不良妊娠結局 不良妊娠結局包括產后大出血、巨大兒、新生兒窒息、胎兒窘迫、新生兒低血糖、死胎,出現以上現象中的1項或多項即為妊娠結局不良。將GDM患者分為妊娠不良組(75例)和妊娠良好組(125例),分析不良妊娠結局的影響因素。

1.4血糖控制標準 采用文獻[7]中的血糖控制計劃,患者空腹血糖水平≤5.3 mmol/L,餐后2 h血糖≤6.7 mmol/L,夜間血糖≥3.3 mmol/L,糖化血紅蛋白(HbA1c)<5.5%。以上條件均達到上述標準判定為血糖控制達標,否則為不達標。每次血糖控制都達標的情況稱為血糖控制良好,每次血糖控制都不達標或忽高忽低的情況稱為血糖控制不良。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結 果

2.1對照組、GDM組外周血PBMC中YY1、miR-181a-5p表達水平比較 與對照組比較,GDM組外周血PBMC中YY1、miR-181a-5p表達水平均明顯下降(P<0.05)。見表2。

表2 對照組、GDM組外周血PBMC中YY1、miR-181a-5p表達水平比較

2.2對照組、GDM組不良妊娠結局發生率比較 與對照組比較,GDM組不良妊娠結局(巨大兒、產后大出血、新生兒低血糖)的發生率明顯較高(P<0.05)。見表3。

2.3GDM不良妊娠結局影響因素的單因素分析 GDM患者不良妊娠結局與年齡(>35歲)、孕前體質量指數(≥24.0 kg/m2)、血糖控制情況(不良)、外周血PBMC中YY1表達水平(降低)、外周血PBMC中miR-181a-5p水平(降低)有關(P<0.05),見表4。

2.4多因素Logistic回歸分析 以GDM患者妊娠結局是否不良(否=0,是=1)為因變量,以表4中P<0.05的因素[年齡(≤35歲=0,>35歲=1)、孕前體質量指數(<24.0 kg/m2=0,≥24.0 kg/m2=1)、血糖控制情況(良好=0,不良=1)、外周血YY1、miR-181a-5p水平]為自變量,進行多因素Logistic回歸分析。年齡>35歲、血糖控制不良均是GDM患者妊娠不良結局的獨立危險因素(P<0.05);外周血YY1、miR-181a-5p表達水平升高均是GDM患者妊娠不良結局的獨立保護因素(P<0.05)。見表5。

2.5外周血PBMC中YY1、miR-181a-5p對GDM患者不良妊娠結局的預測價值 以GDM患者外周血PBMC中YY1、miR-181a-5p水平為檢驗變量,以妊娠結局為狀態變量(良好=0,不良=1)繪制ROC曲線,結果顯示,外周血PBMC中YY1、miR-181a-5p表達水平單獨及二者聯合預測GDM患者不良妊娠結局的曲線下面積(AUC)分別為0.717、0.751、0.832,其中聯合預測的AUC明顯高于二者單獨預測(Z=5.783、7.345,P<0.05)。見圖1、表6。

圖1 外周血PBMC中YY1、miR-181a-5p水平預測GDM患者不良妊娠結局的ROC曲線

表3 對照組、GDM組不良妊娠結局發生率比較[n(%)]

表4 GDM不良妊娠結局影響因素的單因素分析[n(%)或

表5 不良妊娠結局的多因素Logistic回歸分析

表6 外周血PBMC中YY1、miR-181a-5p水平預測HDP不良妊娠結局的價值

3 討 論

隨著中國經濟發展和人民生活水平的提高,GDM在中國女性中的患病率急劇上升。GDM主要的病理特征有β細胞功能障礙及胰島素抵抗。有研究發現,與正常生理性妊娠期女性相比,GDM患者體內β細胞功能降低30%～70%,其葡萄糖攝取量幾乎是正常生理性妊娠期女性葡萄糖攝取量的一半,同時胰島素抵抗現象增加[1]。GDM可導致流產、產后大出血、產后感染、胎兒窘迫、新生兒窒息、新生兒低血糖、巨大兒、死胎的概率直線上升,嚴重損害母嬰的健康[8]。因此,尋找與GDM不良妊娠結局關系密切的因素,對其進行早期識別和干預,可在臨床上緩解孕產婦及新生兒的不良妊娠結局,同時有利于GDM患者的健康[9]。

YY1已被鑒定為具有激活或抑制基因表達的雙重功能的轉錄因子,在多數腫瘤中顯示出促癌作用[10]。有研究結果顯示,在小鼠中敲除YY1后,新生小鼠和成年小鼠的高血糖快速發作,葡萄糖耐量受損及β細胞質量變差,表現出1型糖尿病表型[10]。另外,YY1的低表達可通過誘導NEAT1下調,調節miR-205-3p/MMP16軸,參與糖尿病白內障的發展[11]。本研究中,與對照組比較,YY1表達水平在GDM組外周血PBMC中降低,YY1表達水平升高是不良妊娠結局的獨立保護因素,且其預測不良妊娠結局的AUC為0.717,提示YY1可能參與GDM的發生、發展,對GDM患者不良妊娠結局有一定的預測價值。MARTINS等[12]已證實,小鼠β細胞中YY1表達水平下降與糖尿病密切相關,YY1缺乏、β細胞丟失可導致小鼠在生命早期發展為糖尿病。結合本研究的結果推測,YY1表達水平下降可能導致β細胞功能障礙,正向作用于GDM疾病的發生發展,從而導致不良妊娠結局[8,10-12]。

miRNA是一組內源性非編碼RNA,通常含有約22個核苷酸,可通過與其靶標序列互補結合,在生物學中參與多種途徑和過程[13]。miR-181a-5p最初被發現參與致癌過程,也有研究顯示,miR-181a-5p在糖尿病患者的心肌細胞中表達水平明顯下降[14]。LOZANO-BARTOLOMé等[14]發現,miR-181a-5p在肥胖和糖尿病受試者脂肪組織中的表達下調,與胰島素抵抗的關系密切(呈負相關)。本研究表明,miR-181a-5p表達水平在GDM組外周血PBMC中明顯低于對照組,在妊娠不良組外周血PBMC中的表達水平明顯低于妊娠良好組,miR-181a-5p表達水平升高是不良妊娠結局的獨立保護因素,且其預測不良妊娠結局的AUC為0.751,提示miR-181a-5p可能參與GDM進程,對GDM患者不良妊娠結局有一定的預測價值。SONG等[15]發現,miR-181a-5p表達水平升高有利于改善小鼠對葡萄糖和胰島素的耐量。推測miR-181a-5p表達下調可能促進胰島素抵抗增加,加重GDM疾病,導致GDM患者的不良妊娠結局[8,14]。外周血PBMC中YY1、miR-181a-5p聯合預測GDM患者不良妊娠結局的AUC為0.832,其中聯合預測的AUC明顯高于二者單獨預測,表明外周血PBMC中YY1、miR-181a-5p聯合預測GDM患者的不良妊娠結局效果更好、更準確。

綜上所述,YY1、miR-181a-5p表達水平在GDM患者外周血PBMC中降低,均為不良妊娠結局的獨立保護因素,均可成為GDM患者不良妊娠結局的預測因子。然而GDM的發生機制較為復雜,YY1、miR-181a-5p在GDM中的作用途徑有待進一步研究。