凝血因子Ⅻ rs1801020和抵抗素rs1862513基因多態性與不明原因復發性流產的相關性研究

王 聰,蔣晴晴,姜 雪,孫佳惠,駱 鶯,張 祎

上海市長寧區婦幼保健院:1.檢驗科;2.計劃生育科,上海 200050

我國將復發性流產(RSA)定義為連續兩次及以上妊娠28周前的妊娠丟失,包括生化妊娠[1]。根據美國的研究報道,RSA的發病率為1%～5%,其中不明原因RSA(URSA)占50%[2]。目前已知的RSA原因主要包括母親免疫因素(包括自身免疫和同種免疫)、易栓癥(包括遺傳和獲得性易栓癥)、子宮解剖異常和內分泌異常[1]。有研究顯示,凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺乏與特發性自然流產關系密切。當FⅫ 5′端非翻譯區 ATG 起始密碼子的上游4個堿基處,即FⅫ基因啟動子區第46位核苷酸,C被T替換后,產生了一個新的ATG 起始密碼子。T等位基因破壞了翻譯起始信號的Kozak共識序列(GCCAGCCATGG),導致翻譯效率降低和FⅫ血漿水平降低[3]。

此外,妊娠期脂代謝異常已成為婦產科研究熱點。脂肪細胞因子可通過影響胚胎種植、子宮內環境和母胎免疫平衡等對妊娠過程起作用。對于因不孕接受治療的女性及自然妊娠的女性,脂代謝異常者發生流產的風險均有所增加[4]。抵抗素是白色脂肪組織分泌的脂肪細胞因子,在母體脂肪組織、胎盤和胎膜中表達,與胰島素抵抗、2型糖尿病等疾病的發生、發展有關[5]。抵抗素rs1862513 C/G基因多態性與肥胖相關,而肥胖是不良妊娠結局的危險因素[6]。關于抵抗素rs1862513 C/G基因多態性與URSA發生是否相關的研究較少。本研究采用探針法PCR分析URSA患者FⅫ rs1801020 C/T和抵抗素rs1862513 C/G基因多態性,并與無不良妊娠史的健康產后女性進行比較,從凝血和脂代謝角度探討URSA發生與雙基因位點多態性的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年1月至2022年12月在上海市長寧區婦幼保健院門診就診的189例URSA患者作為研究對象,其中4例在FⅫ rs1801020多態性檢測時結果判讀失敗,余185例檢測成功者為URSA-A組,平均年齡32.7歲;3例在抵抗素rs1862513多態性檢測時結果判讀失敗,余186例為URSA-B組,平均年齡32.7歲。其中182例同時成功檢測了FⅫ rs1801020和抵抗素rs1862513多態性,此182例為URSA-C組,平均年齡32.6歲。所有患者就診前均連續自然流產2次及以上,流產都發生于妊娠28周以前;URSA的診斷標準:(1)B超或子宮輸卵管碘油造影檢查排除子宮畸形或子宮頸機能不全;(2)子宮頸黏液支原體和衣原體檢測排除感染因素;(3)患者夫妻雙方及流產組織的染色體篩查排除染色體異常;(4)激素水平測定排除黃體功能不全、高泌乳素血癥、高雄激素血癥及代謝性疾病、甲狀腺功能異常等;(5)自身免疫性疾病相關抗體篩查,包括抗核抗體、抗心磷脂抗體、狼瘡抗凝物以及抗ENA抗體陰性;(6)患者丈夫的精液檢測結果正常。選擇同期191例無不良妊娠史的健康產后女性作為對照組,對照組均無肝、腎疾病,無自然流產史、早產史、血栓或出血史、妊娠期高血壓史,并且至少有一次成功的妊娠分娩史。對其中138例女性檢測FⅫ rs1801020多態性,此138例為對照A組,平均年齡33.1歲;對其中176例對照女性檢測了抵抗素rs1862513多態性,此176例為對照B組,平均年齡32.9歲;只有123例女性同時檢測了兩個基因位點,此123例為對照C組,平均年齡33.3歲。為保證遺傳背景的一致性,所有受試者均來自上海地區,簽署知情同意書后抽取血液標本。

1.2儀器與試劑 標本采集使用4%枸櫞酸鈉抗凝管?；蚪MDNA提取試劑盒為Universal DNA Extraction Mini kit(佛山奧維生物科技有限公司)。引物、熒光探針和PCR反應試劑盒由南京驥驁生物技術有限公司提供。PCR擴增儀為美國ABI 7500。

1.3方法

1.3.1標本采集 留取URSA組和對照組研究對象2.7 mL外周血,采用4%枸櫞酸鈉抗凝。將全血樣本置于室溫下以1 500×g 離心10 min,將白細胞層收集到1.5 mL Ep管中,-80 ℃冷凍保存。

1.3.2基因組 DNA 提取 應用Universal DNA Extraction Mini kit(佛山奧維生物科技有限公司)進行基因組 DNA提取,操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。獲得的基因組DNA置于-80 ℃冷凍保存。

1.3.3FⅫ rs1801020 C/T 和抵抗素rs1862513 C/G多態性基因型檢測 采用MGB探針法PCR 技術分析 FⅫ rs1801020 C/T 和抵抗素rs1862513 C/G多態性的基因型及等位基因分布。引物及探針序列見表1。PCR反應體系包括0.25 μL 10 μmol/L 探針1/2、0.50 μL 20 μmol/L正、反向引物、2.50 μL DNase/RNase-free H2O2、5.00 μL 2×Mix和1.00 μL模板。依托ABI 7500檢測平臺,PCR反應程序設置為95 ℃, 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,共40個循環。

表1 rs1801020和rs1862513引物及探針序列

2 結 果

2.1FⅫ rs1801020 C/T基因多態性在兩組女性中的分布 兩組女性基本資料對比見表2,URSA-A組孕前體質量和體質量指數(BMI)明顯高于對照A組(P<0.05)。在URSA-A組和對照A組中,FⅫ rs1801020 C/T基因型和等位基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(URSA-A組:χ2=0.05,P>0.05;對照A組:χ2=1.14,P>0.05),說明本研究的樣本為來自總體的一個隨機樣本,具有群體代表性。URSA-A組FⅫ rs1801020 C/T基因型為CC型、CT型和TT型的頻率分別為4.9%、35.7%、59.5%,對照A組FⅫ rs1801020 C/T基因型為CC型、CT型和TT型的頻率分別為8.0%、47.1%、44.9%,兩組3種基因型頻率比較差異有統計學意義(χ2=6.91,P=0.032),但CT、TT基因型頻率分別與CC基因型頻率比較則差異無統計學意義(P>0.05)。URSA-A組等位基因為C和T的頻率分別為22.7%、77.3%,對照組等位基因為C和T的頻率分別為31.5%、68.5%。T等位基因在URSA-A組的分布頻率明顯高于對照A組(χ2=6.32,OR=1.567,95%CI:1.100～2.238,P=0.012),見表3。

表2 兩組基本資料比較

2.2抵抗素rs1862513 C/G基因多態性在兩組女性中的分布 兩組女性基本資料對比見表4,與對照B組相比,URSA-B組孕前體質量和BMI增高(P<0.05)。抵抗素rs1862513 C/G基因型和等位基因分布頻率在URSA-B組和對照B組中均符合Hardy-Weinberg平衡定律(URSA-B組:χ2=0.30,P>0.05;對照B組:χ2=3.48,P>0.05),說明樣本具有群體代表性。URSA-B組抵抗素rs1862513 C/G基因型為CC型、CG型和GG型的頻率分別為11.3%、47.3%、41.4%,對照B組抵抗素rs1862513 C/G基因型為CC型、CG型和GG型的頻率分別為10.2%、34.1%、55.7%,兩組3種基因型頻率比較差異有統計學意義(χ2=7.78,P=0.021),但CG、GG基因型頻率分別與CC基因型頻率比較則差異無統計學意義(P>0.05)。URSA-B組等位基因C和G的頻率分別為34.9%、65.1%,對照B組等位基因C和G的頻率分別為27.3%、72.7%,G等位基因在URSA-B組的分布頻率低于對照B組(χ2=4.96,OR=0.698,95%CI:0.508～0.953,P=0.026),見表5。

表3 兩組FⅫ rs1801020 C/T基因型和等位基因分布頻率的比較[n(%)]

2.3rs1801020 C/T、rs1862513 C/G聯合分析與URSA發生風險的關系 相對于攜帶rs1801020 CC+rs1862513 CC基因型組合的人群,攜帶rs1801020 TT+rs1862513 CG基因型的人群發生URSA的風險明顯增高(OR=5.684,95%CI:1.210～30.920,P=0.035)。見表6。多因素Logistic分析結果表示,FⅫrs1801020 T等位基因可能是URSA的危險性因素(OR=2.78,95%CI:1.33～5.91,P<0.05),抵抗素rs1862513G等位基因可能是URSA的保護性因素(OR=0.51,95%CI:0.27～0.96,P<0.05)。

表4 兩組女性基本資料比較

表5 兩組女性抵抗素rs1862513 C/G基因型和等位基因分布頻率的比較[n(%)]

表6 聯合分析rs1801020 C/T與rs1862513 C/G基因型分布頻率的比較[n(%)]

3 討 論

流產對女性而言是一個全球性的健康問題。尤其在發達國家或地區,受社會經濟或文化的影響,女性的生育年齡往往推遲[7]。RSA的發生率為1%～5%,其中超過50%的RSA者沒有找到導致流產的原因[8]。因此,針對流產發生原因及預防手段開展的相關研究是臨床關注的焦點。遺傳學因素是RSA的主要病因之一[9]。

充足的胎盤血供是孕育生命的基礎,55%的自然流產與凝血缺陷導致的胎盤血管血栓和栓塞有關[10]。RSA患者外周凝血機制改變,胎盤部位有血栓形成,雖然患者體內的高凝狀態不一定會產生較嚴重的血栓疾病,但是往往會導致患者凝血功能增強,纖溶功能下降,故有研究者提出凝血機制的改變可能是RSA的發病機制[11]。FⅫ是由肝臟合成的單鏈糖蛋白,包含596個氨基酸;FⅫ rs1801020 C/T基因多態性是1998年首次報道的,FⅫ第一外顯子5′端非翻譯區的46位點堿基上存在C→T置換[12]。FⅫ rs1801020 C/T基因多態性位點不會引起FⅫ基因的轉錄和mRNA穩定性的下降,但是可引起FⅫ活性降低,因為該位點位于FⅫ 5′端非翻譯區ATG起始密碼子的上游4個堿基處,C被T替換后,產生了一個新的ATG起始密碼子。也有研究者通過研究不同C/T等位基因對FⅫ表達量的影響發現T-FⅫ的蛋白表達量低于C-FⅫ的蛋白表達量[10]。

本研究發現,以FⅫ rs1801020的CC基因型作為參照,URSA組與對照組CT、TT基因型頻率比較差異無統計學意義(P>0.05),而T等位基因在URSA組的分布頻率明顯高于對照組。本研究認為,FⅫ rs1801020的T等位基因可能是育齡期女性URSA的致病危險因素之一。此結果與金艷慧等[13]和章艷等[14]的研究結論不同,他們的研究認為CT型可能與URSA的發生有關。而KATHARINA等[15]在研究高加索地區212例URSA患者與149例對照女性時未發現該位點基因型分布存在差異,這可能與人種、地域、生活習慣不同及研究的樣本量、納入標準、研究方法等因素有關。章艷等[14]還對FⅫ rs1801020不同基因型與FⅫ活性的關系進行了研究,結果顯示,無論在URSA組還是對照組,TT基因型女性FⅫ活性均呈現出明顯下降的趨勢?；贔Ⅻ在纖溶酶原內激活途徑中的作用,FⅫ活性降低后纖溶活性下降,血栓發生的風險升高,這可能解釋了T等位基因與URSA發生可能相關的原因。

除凝血因素外,脂代謝在生殖領域的研究也是一大熱點。脂肪因子不僅參與糖脂代謝、能量消耗、炎癥反應和心血管功能,而且與生殖內分泌關系密切。

抵抗素是富含半胱氨酸的分泌蛋白,自2001年被發現以來,國內外研究熱點集中在其與肥胖、糖尿病之間的關系[16]。作為脂肪生成和脂肪組織的反饋調節器,抵抗素可能對脂肪轉化有抑制作用。SHIGEO等[17]發現,抵抗素在母體脂肪組織、胎盤和胎膜中表達,主要在滋養層細胞中表達,可以調節妊娠期胰島素的敏感性。胎盤滋養細胞抵抗素在足月胎盤組織中的表達高于妊娠早期胎盤組織,孕婦血漿抵抗素水平高于非孕婦血漿抵抗素水平。糖尿病巨嬰母血及臍血抵抗素水平低于對照者,而生長受限胎兒中抵抗素水平高于對照者。因此,母血和臍血抵抗素水平可能與新生兒出生體質量呈負相關[18]。抵抗素可能作為脂肪生成的反饋調節器抑制脂肪轉化。但VITORATOS等[19]研究顯示,妊娠期糖尿病孕婦臍帶血抵抗素水平與健康孕婦無差異。因此,迄今為止,抵抗素在正常和異常妊娠中對胎兒生長和代謝的作用,還沒有統一的結果。

本研究發現,URSA組與對照組抵抗素rs1862513的CG和GG基因型分別與CC基因型頻率比較差異無統計學意義(P>0.05),而G等位基因在URSA組的分布頻率低于對照組。抵抗素rs1862513 G等位基因可能是URSA的一個保護性因素。ZAYANI等[20]的研究發現,rs1862513 C等位基因和rs1862513 G等位基因對刺激蛋白1(Sp1)和刺激蛋白3(Sp3)兩種轉錄因子的結合親和力不同,Sp1和Sp3以更高的親和力結合到rs1862513 G等位基因的DNA元件上,增強抵抗素水平表達。GG基因型攜帶者與CC和CG基因型攜帶者相比血清抵抗素增加。CORTELAZZI等[21]報道從妊娠20周開始即可從臍血中測到抵抗素,并且抵抗素水平與胎齡呈正相關。此外,足月兒出生2 h之內血漿抵抗素水平明顯高于早產兒,并且其水平與出生體質量、身長、BMI呈正相關[22]。結合本研究結果分析,G等位基因可能通過增加抵抗素水平維持胎兒的正常生長發育。URSA組G等位基因頻率低而C等位基因頻率高,抵抗素水平可能低于對照組,不利于胎兒的生長發育從而導致流產的發生。但抵抗素水平除了與rs1862513 C/G基因多態性有關,還受體質量、腰圍、表達部位、妊娠時間等的影響。因此,抵抗素rs1862513基因多態性對URSA的致病機制還需要進一步探索。從兩個基因位點分組基本資料分析,URSA組女性孕前體質量及BMI值均略高于對照組,這也提示URSA組女性的脂質代謝平衡與對照組相比可能有所不同。除此之外,孕前超重或肥胖也會增加妊娠期高血壓、子癇前期、妊娠期糖尿病、早產、巨大兒等不良妊娠結局的發生風險。深入研究脂質代謝對不明原因復發性流產甚至不良妊娠結局影響的作用機制無疑是有重要意義的。

流產是一種多因素的、復雜的疾病,單獨檢測FⅫ rs1801020 C/T基因多態性或抵抗素rs1862513 C/G基因多態性存在一定局限性。本研究聯合分析FⅫ rs1801020 C/T及抵抗素rs1862513 C/G的基因組合與URSA的發生風險之間的關系發現,攜帶rs1801020 TT+rs1862513 CG基因組合的人群相較于攜帶rs1801020 CC+rs1862513 CC基因組合的人群患URSA的風險明顯增高。

綜上所述,FⅫ rs1801020 C/T的T等位基因和抵抗素rs1862513 C/G的G等位基因可能是育齡女性URSA的影響因素,同時攜帶FⅫ rs1801020 TT和抵抗素rs1862513 CG基因型的女性比同時攜帶FⅫ rs1801020 CC和抵抗素rs1862513 CC基因型的女性更容易發生URSA。