急性腦梗死患者CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE基因檢測結果分析

黃福秀,張冬青

中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心:1.消化內科;2.檢驗科,北京 100048

急性腦梗死是腦組織局部急性供血不足或血液阻斷引起血液循環(huán)障礙、缺血缺氧后導致的局部組織軟化及壞死,是危害全人類健康的常見病、多發(fā)病,也是具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率、高復發(fā)率的血管性疾病[1]。目前,針對急性腦梗死臨床多選擇藥物治療,氯吡格雷是國內外腦卒中防治指南推薦的防治藥物[2],葉酸能夠降低血清同型半胱氨酸(Hcy)水平,進而降低缺血性腦損傷[3],他汀類藥物具有抑制脂肪沉積的調脂作用,可保護腦血管[4]。但在臨床用藥中發(fā)現(xiàn),不同的患者對藥物療效及不良反應存在個體差異,這可能與基因多態(tài)性相關[5]。在肝臟細胞色素P450(CYP)酶系中,CYP2C19對于氯吡格雷的代謝發(fā)揮著主要作用[6],亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝的關鍵酶[7],SLCO1B1基因突變可引起OATP1B1轉運他汀類藥物功能降低,造成血藥濃度升高[8],不同APOE的基因型對他汀類藥物的治療效果差異顯著[9]。精準個體化用藥已被廣泛用于臨床[10]。本文采用PCR-熒光探針方法對急性腦梗死人群進行CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE基因位點多態(tài)性分析,從分子水平探討CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性在急性腦梗死人群中的分布,以期為急性腦梗死人群合理用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020—2022年本院神經(jīng)內科收治的急性腦梗死患者400例,其中男229例,女171例;年齡37～96歲,60～101歲,平均年齡68.29歲,患者均為漢族人群,相互之間無親緣關系。納入標準:經(jīng)CT或MRI檢查,符合《各類腦血管疾病診斷要點》中的腦梗死診斷標準[11]。排除標準:(1)嚴重心力衰竭及肝腎功能不全、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及感染;(2)意識障礙;(3)高血壓腦病、短暫性腦缺血發(fā)作、腦實質出血等。

1.2儀器與試劑 血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司),人類CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE基因檢測試劑盒(PCR-熒光探針方法)(武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司),LightCycler?480實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取 將所有研究對象的全血200 μL,嚴格按照天根生化科技有限公司生產(chǎn)的血液DNA提取試劑盒說明書步驟進行操作,試劑盒使用特異性DNA的吸附柱、獨特的緩沖系統(tǒng),可獲得大片段、高純度、穩(wěn)定可靠的基因組DNA,基因組DNA在-20 ℃以下保存,避免反復凍融。

1.3.2CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE基因型的測定 采用武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE基因檢測試劑盒進行檢測,用CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE基因特異引物,分別加入反應液和樣品DNA溶液,PCR反應體系包括特異性引物和探針、內標引物和探針、dNTPs、Taq酶、UNG酶、PCR緩沖液,按試劑盒說明書步驟進行變性處理和條件擴增,包括UNG處理、預變性、PCR循環(huán)擴增,并在循環(huán)結束時采集熒光信號,根據(jù)熒光強度曲線,樣本ROX通道Ct值≤32,有明顯的擴增曲線,同批實驗中弱陽性對照FAM、VIC通道Ct值≤32,有明顯的擴增曲線;空白對照FAM、VIC通道無擴增曲線,無明顯指數(shù)增長期。

1.3.3PCR-熒光探針基因型結果 PCR-熒光探針結果顯示,CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE具有遺傳基因多態(tài)性。將CYP2C19等位基因的純合野生型*1/*17型和*17/*17型定義為超快代謝型,*1/*1型為快代謝型,*1/*2型、*1/*3型、*2/*17型和*3/*17型為中間代謝型,*2/*2型、*2/*3型和*3/*3型為慢代謝型;MTHFR第4個外顯子第677位堿基發(fā)生C到T的突變,純合突變TT型和雜合突變CT型的酶活性下降至純合野生CC型的32%和64%;SLCO1B1常見的單核苷酸多態(tài)性位點388 A>G和521 T>C,可定義*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b為正常代謝型,*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15為中間代謝型,*5/*5、*5/*15、*15/*15為弱代謝型;APOE基因具有E2、E3、E4 3種等位基因,根據(jù)表型不同分為E2型(E2/E2、E2/E3)、E3型(E3/E3、E2/E4)、E4型(E3/E4、E4/E4)。純合野生型樣本檢測結果顯示FAM通道(野生型)檢測結果均為陽性,VIC通道(突變型)檢測結果均為陰性;雜合突變型樣本檢測結果顯示FAM和VIC通道檢測結果均為陽性;純合突變型樣本檢測結果顯示FAM通道檢測結果均為陰性,VIC通道檢測結果均為陽性,結果嚴格根據(jù)人類CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE基因檢測試劑盒說明書進行判定見表1。

續(xù)表1 CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。進行群體遺傳學Hardy-Weinberg平衡檢驗,P>0.05說明群體基因遺傳平衡。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,組間比較采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1400例急性腦梗死患者CYP2C19基因多態(tài)性分布結果 對400例急性腦梗死患者進行CYP2C19基因檢測,CYP2C19基因共有10類基因型,本次檢測出9類基因型,其中氯吡格雷治療療效正常但出血風險增加的基因表型為超快代謝型(*1/*17型和*17/*17型)占比0.25%,療效正常的快代謝表型(*1/*1型)占比44.25%,療效降低的基因表型(*1/*2型、*1/*3型、*2/*17型、*3/*17型)占比45.75%,療效較差存在氯吡格雷抵抗的基因表型(*2/*2型、*2/*3型、*3/*3型)占比9.75%,未檢出*1/*17基因型。見表2。

表2 急性腦梗死組CYP2C19基因多態(tài)性分布[n(%)]

2.2400例急性腦梗死患者MTHFR基因多態(tài)性分布結果 對400例急性腦梗死患者進行MTHFR基因檢測,MTHFR基因C677T是最常見的突變位點,可導致MTHFR活性明顯降低,本次檢測出MTHFR基因C677T位點CC、CT、TT 3種基因表型,MTHFR基因C677T位點CT型和TT型占比78.50%,CC型占比21.50%。見表3。

2.3400例急性腦梗死患者SLCO1B1基因多態(tài)性分布結果 對400例急性腦梗死患者進行SLCO1B1基因檢測,SLCO1B1基因共有9類基因型,本次檢測出6類基因型,Ⅰ類正常肌病風險且藥物耐受劑量較高的野生表型(*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b)占比78.75%,Ⅱ類中度肌病風險且藥物耐受劑量中等的雜合突變型(*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15)占比19.75%,Ⅲ類高度肌病風險且藥物耐受劑量較低的純合突變型(*5/*5、*5/*15、*15/*15)占比1.50%,未檢出*1a/*15、*5/*5、*5/*15這3類基因型。見表4。

2.4400例急性腦梗死患者APOE基因多態(tài)性分布結果 對400例急性腦梗死患者進行APOE基因檢測,APOE基因共有6類基因型,本次檢測出6類基因型,其中療效較好的基因表型(E2/E2、E2/E3)占比12.50%,療效正常的基因表型(E2/E4、E3/E3)占比71.75%,療效較差的基因表型(E3/E4、E4/E4)占比15.75%。見表5。

表3 急性腦梗死組MTHFR基因多態(tài)性分布[n(%)]

表4 急性腦梗死組SLCO1B1基因多態(tài)性分布[n(%)]

表5 急性腦梗死組APOE基因多態(tài)性分布[n(%)]

3 討 論

急性腦梗死是臨床上最常見的腦卒中類型,發(fā)病率有逐年上升的趨勢[12],患病后常存在血壓、血糖、血脂異常、血液流變學改變、內皮細胞炎癥反應損傷等,腦血管內血液黏稠度明顯升高,造成血管嚴重狹窄甚至完全閉塞,臨床通過應用降脂藥物對血脂異常進行調控,使用抗血栓藥物以改善血液流變學指標、減輕炎癥反應,從而盡早恢復腦組織的血液供應[15],但是不同個體應用藥物時療效及不良反應存在較大差異,已有多項研究報道了其與基因多態(tài)性存在明顯關系[14-17],因此檢測藥物相關基因的多態(tài)性對于臨床用藥具有重要意義。

氯吡格雷能夠有效抑制血小板活性,不可逆、選擇性抑制血小板與二磷酸腺苷結合,阻止二磷酸腺苷介導的糖蛋白復合物活化,從而抑制血小板聚集,防止腦梗死病情惡化,是臨床上得以廣泛應用的抗血小板藥物。氯吡格雷主要依賴于CYP2C19代謝生成活性代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗血小板療效,本研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死人群中CYP2C19基因表型主要為快代謝表型(44.25%)、中等代謝型(45.75%)和慢代謝型(9.75%),結果與研究報道的北京地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性分布結果基本相符[18],提示慢代謝型在應用氯吡格雷時抗凝治療時,存在療效較差的可能,應聯(lián)合應用或者更換其他抗凝藥物[19]。

葉酸通過抑制Hcy改善局部血管內皮功能,改善血液動力學指標進而降低腦血管再次栓塞,MTHFR是Hcy代謝的關鍵酶,C677T位點純合突變和雜合突變的酶活性分別下降至野生型的32%和64%,本研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死人群中MTHFR基因C677T位點主要為CT型和TT型(78.50%),臨床上可以增加葉酸的劑量來減少患者腦梗死的復發(fā)率。

他汀類藥物是臨床首選的降脂藥,通過競爭性抑制3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶降低膽固醇的生物合成,有研究顯示SLCO1B1和ApoE的基因多態(tài)性與他汀類藥物的療效密切相關,最重要的不良反應是產(chǎn)生肌肉毒性,嚴重者可能發(fā)生橫紋肌溶解癥,有致命危險[20]。ApoE不同基因表型影響他汀類藥物的療效,本研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死人群中E2型和E3型占比84.25%,提示此類患者應用他汀類藥物時,更可能出現(xiàn)療效較好的情況,E4型占比15.75%,提示此類患者應用他汀類藥物時,療效可能較差。SLCO1B1基因是他汀類藥物發(fā)生不良反應風險的決定因素,78.75%的急性腦梗死患者基因表型為Ⅰ類野生表型,此類患者在應用他汀類藥物耐受劑量較高,肌病風險正常,而有1.50%的急性腦梗死患者基因表型為Ⅲ類純合突變型,此類患者是臨床上需要關注的對象,單獨使用正常劑量的他汀類藥物,可能降脂治療效果不理想,并且存在他汀類藥物的不良反應,可考慮非他汀類降脂藥物(依折麥布、阿利西尤單抗、依洛尤單抗、因立司然、貝派地酸等)替代治療或合并小劑量他汀類藥物聯(lián)合使用[21]。

綜上所述,本研究通過分析400例急性腦梗死患者CYP2C19、MTHFR、SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性的分布,為該類人群的個體化用藥提供了參考依據(jù),以期能夠為臨床上合理用藥、降低藥物不良反應提供數(shù)據(jù)支持,實現(xiàn)臨床的精準用藥,為患者提供個體化用藥方案。