蛇葡萄素通過調節JAK2/STAT3信號通路減輕OGD/R誘導的神經元損傷

弋海群,謝 娟,張象霞,何貴華△,張 偉

重慶市榮昌區人民醫院:1.兒科;2.質管辦;3.院感科,重慶 402460

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是由于早產兒或足月兒出生前或出生時長期腦缺氧缺血引起的臨床綜合征,其死亡率為10%～60%,幸存者中的23%可能會存在長期神經系統后遺癥如智力低下、認知障礙、發育遲緩、腦癱和癲癇等[1]。目前,低溫治療被認為是治療HIE的唯一辦法,但其治療有效率只有50%[2]。因此,進一步了解新生兒HIE的發病機制,尋找更有效的治療方法至關重要。蛇葡萄素(AMP)又稱二氫楊梅素(DHM),是一種來自中草藥天然類黃酮化合物,具有包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗高血壓、保護肝臟和抗癌等多種生物活性和藥理特性[3]。已有研究報道,AMP在多種神經性疾病中發揮作用,且對氧糖剝奪/再灌注(OGD/R)誘導的神經元細胞損傷有保護作用[4]。酪氨酸激酶2(JAK2)是蛋白質-酪氨酸激酶家族的成員,是炎癥反應和細胞增殖分化的重要調節劑[5]。信號傳導及轉錄活化因子3(STAT3)也參與細胞凋亡、增殖和分化,其磷酸化激活受JAK2的調節[6]。已有研究表明,JAK2/STAT3通路的磷酸化/活化與神經保護相關的信號通路之間存在聯系,且調節JAK2/STAT3信號通路可保護OGD/R誘導的細胞損傷[7]。本研究通過構建體外新生大鼠OGD/R誘導的神經元細胞模型,探討AMP對神經元細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料來源 選擇24 h新生SD大鼠,購自廣東南模生物科技有限公司,許可證編號:SCXK(粵)2022-0062。

1.2儀器與試劑 胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、DEME培養基、Neurobasal培養基、B27(北京索萊寶科技有限公司);CCK-8檢測試劑盒、Annexin VFITC/PI檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(上海通蔚實業有限公司);活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(美國默克公司);酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(上海碧云天生物技術有限公司);抗體微觀相關蛋白2(MAP-2)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(C-caspase-3)、JAK2、磷酸化JAK2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化信號傳導及轉錄活化因子3(p-STAT3)和GAPDH(美國Abcam公司);二抗山羊抗兔IgG(南京建成生物工程研究所);JAK2/STAT3激活劑Coumermycin A1(美國MedChemExpress公司)。流式細胞儀(美國BD公司);蛋白電泳儀(美國Bio-rad公司);酶標儀(上海天能生命科學有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1神經元細胞培養 將新生SD大鼠斷頭處死,取出雙側海馬組織,剪碎,胰蛋白酶消化后置于含10% PBS的DMEM培養基終止消化,37 ℃、5% CO2培養4 h后置于含2% B27的Neurobasal培養基培養[8]。神經元培養第7天,用免疫熒光染色加入MAP-2抗體(呈紅色),顯微鏡下觀測MAP-2熒光細胞數,計算神經元細胞的純度。

1.3.2神經元細胞OGD/R模型構建與分組 將培養7 d的神經元細胞置于含有94% N2、5% CO2和1% O2的三氣培養箱中37 ℃培養4 h。隨后更換為Neurobasal培養基在相同條件下培養24 h,構建神經元OGD/R損傷模型[8]。將神經元細胞隨機分為:對照組(AMP濃度為0 μmol/L),OGD/R組(OGD/R處理),AMP低劑量組(OGD/R處理+AMP 20 μmol/L),AMP高劑量組(OGD/R處理+AMP 30 μmol/L),JAK2/STAT3激活劑組(OGD/R處理+AMP 30 μmol/L+Coumermycin A1 10 μmol/L)。其中AMP于OGD/R再灌注開始階段以適量濃度溶于培養基,其使用劑量參照以往研究[4]。而Coumermycin A1于再灌注開始階段和復氧后處理細胞。

1.3.3CCK-8法檢測細胞活力 將神經元細胞加入96孔板中,每孔1×104個細胞,不同濃度AMP(0、5、10、20、30、40 μmol/L)培養24 h后,實驗同時設無細胞對照組(空白),加入10% CCK-8溶液(10 μL)在37 ℃孵育4 h,酶標儀于450 nm處測量吸光度(A),并計算細胞活力(%)=(A神經元細胞-A空白)/(A對照-A空白)×100%。每組6個重復。

將對照組和暴露于OGD/R的各組細胞加入96孔板中,每孔1×104個細胞,培養24 h后加入10 % CCK-8溶液(10 μL)在37 ℃孵育4 h,酶標儀于450 nm處測量吸光度,細胞活力計算方法同上。每組6個重復。

1.3.4培養基中LDH活性檢測 收集各組神經元細胞復氧復糖24 h后的培養液,離心取上清,按照LDH診斷試劑盒測量培養基中LDH,使用微孔板分光光度計在450 nm波長下計算LDH活性,培養基中LDH活性越高,代表細胞釋放的LDH越多,損傷越嚴重。

1.3.5流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組細胞加入6孔板中,每孔1×107個細胞,培養12 h,按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒說明書逐步進行染色,用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.6氧化應激的測定 將各組細胞使用相應的試劑盒測定ROS熒光強度、MDA和SOD的水平。ROS采用FITC熒光檢測,SOD的A值用酶標儀分別在450 nm處測定,MDA的A值在532 nm處測定。

1.3.7炎癥因子水平的測定 將各組細胞離心取上清,用ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.3.8Western blotting檢測蛋白水平 將各組細胞破碎后提取總蛋白,用BCA試劑盒進行濃度定量,按步驟將蛋白SDS-PAGE電泳、轉膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,在4 ℃下加入一抗Bcl-2、Bax、C-caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3(1∶2 000)和GAPDH過夜孵育,清洗,在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG(1∶1 000),孵育2 h。用ECL發光顯影,觀察拍照,各條帶灰度值用Image J軟件處理分析。

2 結 果

2.1神經元細胞純度鑒定 海馬神經元免疫熒光實驗結果顯示,MAP-2主要存在于細胞體和樹突,為紅色熒光。隨機選取10個視野下的100個細胞,統計海馬神經元的陽性細胞數,神經元細胞的純度為(93.61±3.58)%,見圖1。

2.2不同濃度AMP對細胞活性的影響 與AMP濃度為0 μmol/L比較,AMP濃度在5～30 μmol/L時,不影響神經元細胞的活力(P>0.05),當AMP濃度為40 μmol/L時,神經元細胞活力明顯下降(P<0.05)。見表1。

圖1 海馬神經元MAP-2免疫熒光染色的鑒定(×200)

表1 不同濃度AMP對細胞活力的影響

2.3各組細胞活力和培養基中LDH活性的變化 與對照組比較,OGD/R組細胞活力明顯下降,培養基中LDH活性明顯升高(P<0.05);與OGD/R組比較,AMP低、高劑量組細胞活力明顯升高,培養基中LDH活性明顯下降(P<0.05);與AMP高劑量組比較,JAK2/STAT3激活劑組細胞活力明顯下降,培養基中LDH活性明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞活力和培養基中LDH活性的變化

2.4各組細胞凋亡情況 與對照組比較,OGD/R組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與OGD/R組比較,AMP低、高劑量組細胞凋亡率明顯下降(P<0.05);與AMP高劑量組比較,JAK2/STAT3激活劑組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05),見圖2、表3。

注:A為對照組;B為OGD/R組;C為AMP低劑量組;D為AMP高劑量組;E為JAK2/STAT3激活劑組。

表3 各組細胞凋亡情況

2.5各組細胞氧化應激指標水平變化 與對照組比較,OGD/R組細胞ROS熒光強度、MDA水平明顯升高,SOD水平明顯降低(P<0.05);與OGD/R組比較,AMP低、高劑量組細胞ROS熒光強度、MDA水平明顯下降,SOD水平明顯升高(P<0.05);與AMP高劑量組比較,JAK2/STAT3激活劑組細胞ROS熒光強度、MDA水平明顯升高,SOD水平明顯降低(P<0.05)。見表4。

2.6各組細胞炎癥因子水平變化 與對照組比較,OGD/R組細胞IL-6、TNF-α水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05);與OGD/R組比較,AMP低、高劑量組細胞IL-6、TNF-α水平明顯下降,IL-10水平明顯升高(P<0.05);與AMP高劑量組比較,JAK2/STAT3激活劑組細胞IL-6、TNF-α水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05)。見表5。

表4 各組細胞氧化應激指標水平變化

表5 各組細胞炎癥因子水平變化

2.7各組細胞蛋白表達水平變化 與對照組比較,OGD/R組細胞Bax、C-caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白水平明顯升高,Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05);與OGD/R組比較,AMP低、高劑量組細胞Bax、C-caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白水平明顯下降,Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05);與AMP高劑量組比較,JAK2/STAT3激活劑組細胞Bax、C-caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平明顯升高,Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)。見表6、圖3。

表6 各組細胞蛋白表達水平變化

注:A為對照組;B為OGD/R組;C為AMP低劑量組;D為AMP高劑量組;E為JAK2/STAT3激活劑組。

3 討 論

HIE是全球范圍內新生兒死亡和殘疾的主要原因,其病理生理因素包括炎癥、興奮性毒性、氧化應激、神經元細胞死亡等[9]。但目前仍然缺乏有效的HIE治療方法,因此迫切需要尋找一種新的治療策略來改善神經元損傷,從而恢復神經功能。本研究發現,OGD/R誘導的神經元細胞活力下降,LDH活性和神經元凋亡率升高,表明OGD/R會導致神經元細胞損傷。AMP是一種天然存在于葡萄、水果、蔬菜和草藥中的類黃酮化合物,因其具有抗氧化應激、抗炎、抗癌、抗菌、抗凋亡和神經保護等生物活性而被廣泛應用[10]。已有研究發現,AMP對OGD/R誘導的神經元細胞損傷有較好的保護作用,李娜等[4]發現,AMP能抑制OGD/R誘導的小鼠神經元細胞氧化應激損傷。本研究結果顯示,AMP能提高OGD/R導致的神經元細胞活力下降,降低LDH活性和神經元細胞凋亡率,與以往報道相似,提示AMP能減少神經元細胞損傷。

炎癥、氧化應激在OGD/R造成的腦損傷過程中起著非常重要的作用,OGD/R引發腦神經元細胞氧化系統失衡,進而誘導炎癥反應和神經元細胞凋亡[11]。本研究中,OGD/R誘導的神經元細胞ROS熒光強度、MDA、IL-6、TNF-α水平升高,SOD、IL-10水平降低,表明OGD/R會造成神經元細胞發生氧化應激和炎癥反應,最終造成神經元細胞損傷甚至死亡。神經元細胞凋亡是HIE最重要的病理生理學表現,細胞凋亡相關蛋白的異常表達被認為是細胞死亡的標志物[12]。本研究中,OGD/R誘導的神經元細胞Bax、C-caspase-3蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低,表明OGD/R會促進神經元細胞凋亡。TAO等[13]發現,AMP能保護小鼠海馬神經元HT22細胞免受OGD/R誘導的氧化應激和細胞凋亡。同時,XIE等[14]發現,AMP能抑制OGD/R誘導的HT22細胞凋亡,降低脂質ROS活性和鐵的水平。本研究結果顯示,AMP可降低OGD/R處理導致的神經元細胞ROS熒光強度、MDA、IL-6、TNF-α及Bax、C-caspase-3蛋白水平,升高SOD、IL-10和Bcl-2蛋白水平,表明AMP對OGD/R處理導致的氧化應激、炎癥和凋亡蛋白的表達有抑制作用。

JAK2/STAT3途徑是一種調節基因表達和細胞活力的信號轉導途徑,具有調節細胞死亡和凋亡、抑制神經炎癥和改善氧化應激的功能[15]。JAK2/STAT3信號通路表達主要通過JAK2蛋白活化激活STAT3,進而磷酸化STAT3,從而發揮一系列生物作用[16]。ZHU等[5]發現,JAK2/STAT3信號通路與缺血性腦損傷關系密切,負調節JAK2/STAT3途徑可減輕缺血性損傷,減少OGD/R誘導的HT22細胞凋亡并促進細胞存活。此外,ZHU等[17]發現,JAK/STAT途徑抑制劑可通過抑制JAK2/STAT3通路減少NLRP3炎小體激活,改善缺血性卒中損傷和神經炎癥。本研究結果顯示,OGD/R誘導的神經元細胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白水平升高,與上述研究結果一致,表明OGD/R可能促進神經元細胞JAK2、STAT3蛋白的磷酸化激活,促進炎癥和氧化應激的發生。AMP已被證實通過抑制JAK2/STAT3信號通路誘導骨肉瘤細胞凋亡,以及抑制脂多糖誘導的炎癥反應[18-19]。本研究中,AMP可明顯降低OGD/R誘導的神經元中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白水平升高。而AMP高劑量加JAK2/STAT3激活劑干預后神經元細胞活力、SOD、IL-10、Bcl-2蛋白水平下降,LDH活性、細胞凋亡率、ROS熒光強度、MDA、IL-6、TNF-α、Bax、C-caspase-3、p-JAK2、p-STAT3蛋白水平升高,表明AMP可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路來減輕OGD/R誘導的神經元細胞損傷。

綜上所述,AMP能通過減少氧化應激和炎癥反應來減輕OGD/R誘導的神經元細胞損傷,其作用機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路磷酸化有關。本研究為治療OGD/R誘導的神經元損傷提供了新思路,為治療HIE患兒提供了新方法,但AMP對HIE神經元細胞損傷的保護作用的具體分子機制仍有待闡明。