基于畢赤酵母制備的SARS-CoV-2 RBD重組蛋白疫苗的免疫方案優化及不同佐劑對中和抗體滴度的影響

王 恒,蔣藎芳,劉 柯,馬慶慶

遵義醫科大學附屬航天醫院:1.檢驗科;2.中心實驗室,貴州遵義 563000

目前,新型冠狀病毒感染(COVID-19)的流行趨勢已被有效遏制,但新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)作為一種具有高變異性的病毒,其對人類的健康仍可能存在威脅,在保持必要警惕的同時,仍需不斷優化相關免疫措施。接種重組蛋白疫苗仍是最經濟高效的防控措施。SARS-CoV-2能夠編碼4種結構蛋白:刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白[1]。其中S蛋白上的受體結合域(RBD)被認為能誘導強烈的保護性抗病毒免疫應答,可作為研究病毒抑制劑和疫苗的主要抗原靶標[2]。目前,重組蛋白疫苗的生產可通過多種表達系統實現,相對而言,畢赤酵母系統對于COVID-19疫苗的開發相對更具優勢[3]。另有研究表明,重組蛋白在沒有佐劑的情況下其所能誘導的免疫反應較弱[4-5]。故將重組RBD蛋白用作COVID-19候選疫苗時應選擇合適的佐劑以克服其弱免疫反應的不足。鋁佐劑作為一種標準佐劑,已用于批準的SARS-CoV-2疫苗,如EpiVacCorona和ZF2001[6-7]。然而單純的鋁佐劑在誘導Th1型細胞免疫方面仍存在不足[8]。CpG佐劑作為一類TLR9激動劑,除激活體液免疫之外,還能有效增強細胞免疫應答[9]。將鋁佐劑+CpG佐劑應用于RBD抗原蛋白制劑體系,或許能更充分激發體液免疫和細胞免疫應答[10]。本研究以結構生物學設計為指導設計RBD抗原蛋白,利用畢赤酵母系統進行重組分泌表達,優化生產工藝,并結合鋁佐劑和CpG佐劑進行免疫原性研究,旨在為SARS-CoV-2 疫苗的持續優化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1質粒構建 參考GenBank數據庫SARS-CoV-2冠狀病毒的全長基因序列(Accession Number:MN908947),得到病毒的RBD序列,針對畢赤酵母系統進行密碼子優化。在RBD的N末端插入α因子信號肽以提高蛋白翻譯效率,在C末端插入腸激酶(EK)可切割的6×His標簽進行純化,重組質粒命名為wtRBD-co,合成序列見表1。將RBD片段亞克隆至pPICZ A表達載體中以構建pPICZα A-wtRBD-co質粒。對SARS-CoV-2 RBD序列進行密碼子優化,重組質粒命名為wtRBD-co1,合成序列見表1。合成的基因插于pUC57質粒載體,以該質粒為模板,使用引物對3/4對wtRBD-co1進行PCR擴增;以pPICZα A為模板,使用引物對1/2獲取α-因子片段。使用引物對1/4采用重疊延伸PCR技術將以上兩個PCR產物片段連接,并通過EcoRⅠ/SaIⅠ雙酶切克隆到載體pPICZ A中,所得質粒命名為pPICZα A-wtRBD-co1。接著,以pPICZα A-wtRBD-co1為模板,使用引物對1/5和4/6對Delta SARS-Cov-2 RBD進行L452R和T478K位點特異性誘變,使用引物對1/4采用重疊延伸PCR技術將以上兩個PCR片段連接,并通過EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切克隆到載體pPICZ A中,所得質粒命名為pPICZα A-Delta RBD-co。本研究使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具體引物序列見表1。

1.2重組畢赤酵母的克隆 重組質粒pPICZα A-wtRBD-co和pPICZα A-Delta RBD-co經SacⅠ線性化后,通過電穿孔法轉化至畢赤酵母 X33(GenePulser Xcell 電穿孔儀,Bio-Rad),并鋪板在含100 μg/mL zeocin的YPDS瓊脂平板上,在30 ℃下選擇與wtRBD-co或Delta RBD-co基因整合的酵母克隆,再利用引物5′AOX和3′AOX(表2)進行菌落PCR鑒定,選擇陽性克隆并將重組菌株接種于3 mL BMGY培養基中,30 ℃、250 r/min振蕩培養,直至吸光度(A)600達到2.0～6.0。接著取菌液于4 ℃下以3 000 r/min離心5 min收獲酵母細胞,將收集的菌體重懸于等體積的含0.5%(V/V)甲醇的BMMY培養基中,于30 ℃下250 r/min振蕩誘導72 h,每隔24 h向培養基中補加0.5%(V/V)的甲醇。通過蛋白質印跡分析定量單個酵母克隆上清液中RBD蛋白的表達水平。

1.3RBD蛋白的表達與純化 如前所述,將選定的酵母克隆在300 mL BMGY培養基中培養,并在誘導后約72 h后,以15 000 r/min在4 ℃下離心15 min收獲上清液。將含有wtRBD或Delta RBD的上清液用0.22 μm過濾器過濾后,用HisTrap HP 5 mL色譜柱(美國GE公司)進行純化,然后采用HitrapQ陰離子交換柱(HiTrap Q HP,美國GE公司)和尺寸排阻柱(Superdex 200 increase 10/300 GL,美國GE公司)做進一步純化。將純化后的蛋白用腸激酶[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]在4 ℃下消化過夜以切割6×His標簽。在含有20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)和150 mmol/L NaCl的緩沖液中,通過HiTrap Q HP色譜柱和Superdex 200 increase 10/300 GL色譜柱去除腸激酶和標簽。在含有1%溴酚藍、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)、50%甘油和60 mmol/L Tris-HCl(pH6.8)的上樣緩沖液中于95 ℃孵育10 min使樣品變性,然后用10%十二烷基硫酸液-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。用考馬斯藍R-250染色,進行膠掃描純度分析或者將蛋白轉至PVDF膜(美國Millipore公司)進行蛋白質印跡分析,先于室溫下用含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉2 h,然后將膜與一抗SARS-CoV-2 RBD(1∶2 000,北京義翹神州科技股份有限公司,Cat#40592-T62)于4 ℃孵育過夜,最后采用二抗抗兔IgG(1∶4 000,亞科因生物技術有限公司)在室溫下孵育1 h。使用化學發光檢測試劑盒(ECL)進行光信號檢測。

表1 SARS-CoV-2 RBD的密碼子優化序列

表2 用于構建質粒的引物序列

續表2 用于構建質粒的引物序列

1.4wtRBD糖基化位點分析 使用液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS,賽默飛Q Exactive Plus LCMS 系統)進行wtRBD的糖基化位點分析。將純化的wtRBD蛋白在-20 ℃下用四體積的預冷丙酮沉淀過夜。收集蛋白質沉淀,20 000×g離心10 min。將蛋白質沉淀物重新溶解于變性緩沖液(8 mol/L尿素,50 mmol/L NH4HCO3),并在55 ℃下用20 mmol/L DL-二硫蘇糖醇(DTT,美國西格瑪公司 )還原1 h,在室溫并避光條件下用55 mmol/L碘乙酰胺(IAA,美國西格瑪公司)烷基化30 min,然后在37 ℃下用胰蛋白酶(1∶50 w/w)消化過夜。消化后根據制造商的說明用ZipTipC18微量層析柱(美國Millipore公司)脫鹽,最后使用EASY-nanoLC1200系統(德國賽默飛公司)偶聯Q Exactive HF-X(德國賽默飛公司)超分辨率質譜儀平臺進行質譜分析。原始MS文件使用帶有SEQUEST的Proteome Discoverer蛋白質組學軟件2.3做進一步處理。

1.5重組RBD蛋白的動物免疫原性試驗 選擇6～8 周齡(19～21 g),健康雌性BALB/c小鼠,隨機分組后,對小鼠進行肌肉注射鋁佐劑或混合佐劑(45 μg鋁佐劑+10 μg CpG)和免疫蛋白(wtRBD或Delta RBD),總體積為100 μL。然后根據既定免疫方案再進行兩次加強免疫。在每次免疫后的第14天和第28天對小鼠進行眼眶采血200 μL,將血液樣品在室溫下放置2 h,然后在4 ℃下以4 000 r/min離心30 min收集血清。將血清樣品儲存在-80 ℃條件下待檢。

1.6檢測小鼠RBD特異性抗體滴度 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清樣品中的RBD特異性抗體。ELISA板(美國康寧公司)每孔預包被200 ng抗原,包括wtRBD、Beta RBD、Delta RBD。將這些抗原在包被緩沖液(35 mmol/L碳酸氫鈉和15 mmol/L碳酸鈉,pH 9.6)中稀釋并于4 ℃下孵育過夜。用PBST緩沖液(含有0.05%吐溫-20的PBS緩沖液)進行洗板,每孔300 μL,洗3遍,每孔加入300 μL封閉液(2%脫脂奶粉)進行封閉,放置于37 ℃恒溫培養箱中靜置1.5 h,使用洗脫液(PBST緩沖液)進行洗板,每孔300 μL,洗5遍,棄掉PBST緩沖液,將帶有HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體用5%的脫脂奶粉按1∶5 000稀釋,以每孔100 μL加入酶聯板中,37 ℃溫箱孵育1.5 h,最后,每孔加入100 μL顯色劑TMB,避光靜置20 min后,每孔加入100 μL終止液(2N HCl)。使用酶標儀在450 nm處測量A值,并在630 nm處進行背景校正。根據LI等[11]先前描述的方法計算血清抗體滴度。

1.7假病毒中和實驗 重組水皰性口炎病毒(VSV)的野生型和變異型SARS-CoV-2假病毒購自中國食品藥品檢定研究院。中和試驗于P3環境下開展完成。檢測時,將培養基稀釋的不同稀釋度血清與等體積的稀釋至100 TCID50/0.05 mL的假病毒一同在96孔板中于37 ℃孵育中和1 h后,將混合液加入培養有Vero E6細胞的96孔板內進行侵染,在37 ℃下用5% CO2孵育24 h,在顯微鏡下觀察并記錄各孔的細胞病變效應,并通過Reed-Muench法則計算血清抑制50%細胞病變效應時的抗體中和滴度。具體操作參考文獻[12]。

2 結 果

2.1重組wtRBD蛋白的表達與驗證 畢赤酵母中表達的重組wtRBD蛋白的表達載體示意圖見圖1A。純化后,經SDS-PAGE電泳并通過考馬斯亮藍染色,結果顯示,表達的重組wtRBD蛋白相對分子質量為45×103,見圖1B,同時通過應用抗RBD(SARS-CoV-2)和抗His抗體進行的蛋白質印跡分析獲得進一步證實,見圖1C,另外,EK消化后未檢測到His標簽,表明幾乎所有蛋白質標簽均能有效被去除,所測得相對分子質量明顯高于預估值(26×103),表明純化的wtRBD高度糖基化,使用液相質譜-質譜聯用技術(LC-MS)分析糖基化位點,蛋白質組學軟件所鑒定的O-糖基化位點和N-糖基化位點見表3。

2.2畢赤酵母表達的wtRBD引發的針對SARS-CoV-2的免疫應答 為評估畢赤酵母表達的wtRBD作為疫苗的免疫效能,設計免疫方案1見圖2A,將小鼠隨機分為3組,各組分別接種0、30、60 μg wtRBD進行免疫,同時聯合應用45 μg鋁佐劑,共進行3次免疫,間隔時間為28 d,每次免疫后第14天采集血清樣本用以檢測wtRBD特異性IgG抗體和中和抗體(NAb),結果顯示,在接種了30、60 μg wtRBD的小鼠中均誘導了明顯的免疫應答,見圖2B,且在第2、3次免疫接種后,檢測到wtRBD特異性IgG抗體和NAb均明顯增加,見圖2B、C,但接種30、60 μg wtRBD的兩組小鼠所檢測到的抗體水平差異無統計學意義(P>0.05)。

研究還設計了另一個免疫方案來評估畢赤酵母表達的wtRBD作為疫苗的免疫效能,免疫方案2見圖3A,3組小鼠wtRBD的接種劑量分別為0、30、100 μg,接種間隔時間為42 d,其他處理方法同方案1,結果與方案1一致,第2、3次免疫接種后,檢測到wtRBD特異性IgG和NAb均明顯增加,見圖3B、C,但接種30、100 μg wtRBD的兩組小鼠所檢測到的抗體水平差異無統計學意義(P>0.05)。

注:A為畢赤酵母中表達的重組wtRBD蛋白的表達載體示意圖;B為通過考馬斯藍染色對純化的重組wtRBD蛋白進行純度分析;C為應用抗RBD(SARS-CoV-2)和抗His抗體進行的蛋白質印跡分析。

表3 LC-MS分析wtRBD蛋白的糖基化位點

2.3接種wtRBD小鼠抗血清對SARS-CoV-2變異株的交叉反應性 為分析不同接種間隔時間接種wtRBD小鼠抗血清是否能有效預防性免疫SARS-CoV-2變異株,收集免疫方案1、2接種wtRBD小鼠的終點血清樣品檢測總IgG抗體和NAb滴度,結果顯示,兩種免疫方案下,wtRBD誘導IgG抗體以相似的效率結合野生型、Beta(B.1.351)和Delta(B.1.617.2)變體,見圖4A;在免疫方案1中,與野生型SARS-CoV-2的NAb滴度相比,針對Beta變體的NAb滴度差異無統計學意義(P>0.05),然而在接種30和60 μg wtRBD的組中,針對Delta變體的NAb滴度分別降低了2.0倍和2.5倍,見圖4B;此外,與免疫方案2比較,免疫方案1所獲得的NAb滴度明顯更高,且總體來看,Delta變體較野生型和Beta變體表現出更強的免疫逃逸能力,見圖4B。

2.4畢赤酵母表達的Delta RBD蛋白誘導小鼠免疫應答 鑒于Delta變體較強的免疫逃逸能力,本研究進一步考察了Delta RBD蛋白的疫苗有效性,其表達載體示意圖見圖5A,純度分析及蛋白質印跡分析見圖5B、C。為評估畢赤酵母表達的Delta RBD的免疫原性,設計免疫方案3見圖6A,Delta RBD二次免疫后特異性IgG抗體明顯升高,第3次免疫后進一步升高,見圖6B,在研究終點(第84天),血清中Delta RBD特異性IgG的幾何平均滴度為1 028 641(7 844～3 720 491),與使用wtRBD免疫下定量的幾何平均滴度相似,見圖6C,但針對Delta變體的NAb幾何平均滴度為32 255(2 167～88 084),見圖6D,相較wtRBD免疫增加了5.2倍,后者為6 202(899～16 199),見圖6E。

2.5鋁佐劑+CpG佐劑聯合Delta RBD對免疫反應的影響 將小鼠分為6組見表4,按照免疫方案3進行免疫。結果顯示,第2次免疫后,無論是5 μg抗原組還是30 μg抗原組,采用鋁佐劑+CpG組別血清中Delta RBD特異性IgG滴度明顯高于單獨采用鋁佐劑組;無論是鋁佐劑+CpG組還是單獨采用鋁佐劑組,5 μg抗原組和30 μg抗原組中Delta RBD特異性IgG滴度基本相當;第3次免疫后,5 μg抗原組與30 μg抗原組中Delta RBD特異性IgG滴度差異無統計學意義(P>0.05),見圖7A。采用研究終點血清樣本檢測針對Delta變體的NAb滴度,結果顯示,在采用5 μg Delta RBD免疫情況下,4組的NAb滴度為3組的9.8倍(385 546vs.39 494),在采用30 μg Delta RBD免疫情況下,6組的NAb滴度為5組的10.4倍(335 614vs.32 255),見圖7B。

注:A為免疫方案1示意圖;B為免疫方案1下3組小鼠血清中wtRBD特異性IgG抗體水平比較;C為免疫方案1下3組小鼠血清中NAb水平比較;*P<0.05,***P<0.001,ns為P>0.05。

注:A為免疫方案2示意圖;B為免疫方案2下3組小鼠血清中wtRBD特異性IgG抗體水平比較;C為免疫方案2下3組小鼠血清中NAb水平比較;*P<0.05,***P<0.001,ns為P>0.05。

表4 鋁佐劑+CpG佐劑聯合Delta RBD處理小鼠分組

注:A為針對Beta變體和Delta變體的IgG結合抗體的滴度;B為針對Beta變體和Delta變體的NAb滴度;n=4,圖中標注數字為幾何平均滴度值。

注:A為酵母中表達的重組Delta RBD蛋白的表達載體示意圖;B為通過考馬斯藍染色對純化的重組Delta RBD進行純度分析,M為蛋白Marker;C為應用抗RBD(SARS-CoV-2)和抗His抗體進行的蛋白質印跡分析。

注:A為免疫方案3示意圖;B為血清中Delta RBD特異性結合IgG抗體的檢測結果(2nd和3nd分別表示第2次和第3次免疫后);C為用wtRBD(紅色)或Delta RBD(藍色)免疫小鼠血清中Delta RBD特異性IgG滴度的檢測;D為研究終點(第84天),血清中針對Delta變體的Nab滴度的檢測;E為研究終點(第84天),用wtRBD(紅色)或Delta RBD(藍色)免疫小鼠血清中針對Delta變體的Nab滴度的檢測;*P<0.05,***P<0.001,ns為P>0.05。

注:A為血清中Delta RBD特異性IgG抗體滴度的檢測(2nd和3nd分別表示第2次和第3次免疫后);B為用研究終點血清樣品中檢測針對Delta變體的NAb滴度;*P<0.05,***P<0.001,ns為P>0.05。

3 討 論

當前世界各地已經使用了多種疫苗來預防COVID-19,其效果較好。最新統計數據顯示,全球70.0%的人至少接種了1劑COVID-19疫苗,但在某些低收入國家,至少接種了1劑COVID-19疫苗的人數仍不足10%[13]。這可能也是Beta、Delta和Omicron變體曾在南非引起3個流行高峰的重要原因之一。國家衛生健康委員會也提出,當前SARS-CoV-2仍在不斷變異,在嚴格落實“乙類乙管”各項措施的同時,需持續加強公共衛生、疾病防控、醫療服務體系建設,以防止新型變異株造成我國疫情大幅反彈的發生。鑒于此,持續優化疫苗免疫方案仍具有重要的現實意義。

SARS-CoV-2的RBD區具有很強的誘導NAb的能力,因此被公認為是COVID-19疫苗的主要靶抗原之一。而對于SARS-CoV-2 RBD的重組表達,已有研究表明,酵母細胞是一種比哺乳動物細胞更具可擴展性和成本效益的表達系統[14]。本研究采用畢赤酵母系統進行RBD蛋白的重組表達,為了增加蛋白表達量,在進行基因設計時于RBD的N末端插入了α因子信號肽。經SDS-PAGE電泳和蛋白質印跡分析檢測結果表明,無論目標蛋白是wtRBD還是Delta RBD,均能通過畢赤酵母系統獲得滿意過表達,說明α因子信號肽的插入能高效引導目標蛋白的翻譯。另外為了便于重組RBD蛋白的純化,于C末端插入了His標簽,然而,很少有人關注純化過程中標簽的消除,這可能會在臨床應用中引起安全問題。為了克服這一限制,故在RBD和His標簽之間增加了一個高效且特異性的EK切割位點,結果顯示,經EK消化后未檢測到His標簽。本研究獲得的重組wtRBD蛋白的相對分子質量為45×103,比以往研究中哺乳動物細胞和昆蟲細胞中表達的重組RBD蛋白相對分子質量相對更高[15]。推測可能是由于畢赤酵母表達的蛋白存在大量的翻譯后修飾,包括糖基化等,這需要進一步驗證。

由于重組蛋白疫苗的免疫原性較低,通常需要多次免疫[4]。因此,筆者探討了疫苗免疫效能是否會受到免疫間隔時間的影響。在本研究中,以28 d或42 d的間隔進行3次wtRBD免疫接種。與42 d間隔時間相比,28 d間隔時間的IgG抗體滴度增加了1.8倍(44 923vs.80 507)。同樣,間隔28 d的3劑免疫后,針對Delta變體的NAb幾何平均滴度比間隔42 d高2.5倍(2 191vs.891)。結果表明,28 d的免疫間隔比42 d的免疫間隔可引發更多的保護性免疫反應。特別需要注意的是,當前預防SARS-CoV-2的主要不確定因素是某些可能出現的新變種,因此關注的重點應是曾被世界衛生組織列為“須關切變體(VOC)”的變異毒株,Delta變異株即為其中之一。本研究發現,用wtRBD疫苗免疫的小鼠血清中針對Delta變體的NAb滴度明顯降低,這與以前的研究一致[15]。為解決該問題,研究中筆者還制備了Delta RBD重組蛋白疫苗,并聯合鋁佐劑對小鼠進行免疫,結果發現,該疫苗針對Delta變體引發了強烈的免疫反應,其針對Delta變體的NAb幾何平均滴度達到了32 255(2 167～88 084)。

為進一步提高重組Delta RBD蛋白的免疫原性,本研究將新型CpG佐劑與傳統鋁佐劑聯合應用。瘧疾疫苗MSP1 42-C1和COVID-19疫苗SCB-2019臨床試驗的證據表明,CpG是一種安全有效的佐劑,使用鋁佐劑和CpG佐劑的組合可以誘導產生更多的NAb。本研究結果顯示,在采用5 μg或30 μg Delta RBD免疫情況下,鋁佐劑+CpG組的NAb滴度均為單獨采用鋁佐劑組的10倍,該結果與其他研究基本一致[15]。提示CpG佐劑的加入更有助于誘導針對SARS-CoV-2及其變體的高度保護性免疫應答。此外,第3次免疫后,5 μg抗原組與30 μg抗原組中Delta RBD特異性IgG滴度無明顯差異,表明使用5 μg的Delta RBD即可達到保護性免疫應答水平。同時,如此低劑量的抗原也意味著將Delta RBD作為抗Delta SARS-CoV-2變異株的候選疫苗具有巨大潛力。

綜上所述,本研究進一步明確了采用畢赤酵母系統生產SARS-CoV-2 RBD蛋白并以此為抗原制備重組蛋白疫苗的可行性,其中,基于畢赤酵母制備的Delta RBD重組蛋白與鋁佐劑+CpG佐劑的聯合免疫能夠獲得更高滴度的NAb以對SARS-CoV-2及其變體發揮免疫作用,可為SARS-CoV-2 疫苗的持續優化研究提供一定參考。