甲基化SIM2、GNA12、CTGF在子癇前期孕婦中表達水平及其對疾病的預測價值

張 闊,陳 瑩,劉 丹,汪俊紅

唐山市婦幼保健院產科,河北唐山 063000

子癇前期是指女性妊娠期出現的不明原因的高蛋白血癥和高血壓,嚴重時可導致孕婦多臟器衰竭甚至死亡[1]。關于子癇前期發病機制目前仍有較多爭論,大多數學者認為其致病過程與機體免疫、遺傳、炎癥、內分泌及外周環境等多因素相互作用有關[2]。研究表明,DNA甲基化可以在不改變DNA順序的情況下影響基因表達和表型狀態,從而影響生物遺傳學特征[2]。而有研究發現,生殖細胞表觀遺傳學改變可致胎盤缺陷,最終誘導子癇前期發生[3]。以往研究發現,子癇前期患者單意同源物2(SIM2)、結締組織生長因子(CTGF)及基因鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(GNA12)等游離DNA與子癇前期的發生及疾病嚴重程度具有一定相關性,但上述基因的甲基化水平是否與子癇前期有關尚不明晰[4-6]?；诖?本研究將探究子癇前期孕婦血漿中甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平及其對子癇前期發生的預測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2022年1—12月在本院確診的82例子癇前期孕婦作為觀察組。納入標準:(1)年齡>18歲;(2)臨床表現及實驗室檢查結果符合子癇前期的診斷標準,孕20周后出現收縮壓≥140 mmHg,或舒張壓≥90 mmHg,伴有24 h尿蛋白≥0.3 g、隨機蛋白尿1+以上[7];(3)經超聲確診為單胎妊娠,且為自然受孕;(4)未合并其他妊娠期特殊疾病(如妊娠期糖尿病等);(5)患者及家屬均知情同意。排除標準:(1)入組時存在嚴重心血管、腦、肺等器官功能障礙及嚴重基礎疾病;(2)合并任何類型惡性腫瘤;(3)合并急、慢性感染;(4)接受過任何類型降血壓藥物治療;(5)身體一般狀況較差,需要終止妊娠。將觀察組進一步分為重度子癇前期組和輕度子癇前期組,符合以下任意1項即判定為重度子癇前期:(1)血壓持續升高至收縮壓≥160 mmHg、舒張壓≥110 mmHg;(2)蛋白尿>3 g/24 h;(3)血肌酐≥90 μmol/L;(4)少尿≤500 mL/24 h或≤25 mL/h;(5)血小板計數減少<100×109/L;(6)肝細胞壞死伴丙氨酸氨基轉移酶或天門冬氨酸氨基轉移酶>2倍正常值;(7)持續性或嚴重的上腹疼痛或右肋痛;(8)伴隨胸痛、呼吸困難或急性肺水腫;(9)合并嚴重神經系統癥狀[7]。另選取同期82例健康孕婦作為對照組。觀察組平均年齡(28.87±1.26)歲,平均體質量指數(25.59±1.54)kg/m2,平均孕周(30.43±1.63)周,既往有妊娠史16例,既往有吸煙史13例,既往有飲酒史17例。對照組平均年齡(28.70±1.25)歲,平均體質量指數(25.97±1.58)kg/m2,平均孕周(30.76±1.59)周,既往有妊娠史17例,既往有吸煙史15例,既往有飲酒史15例。兩組孕婦的一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2方法

1.2.1標本采集及處理 通過含EDTA抗凝劑的負壓采血管收集所有患者空腹外周靜脈血5 mL,2 h內以3 000 r/min在室溫下離心15～20 min,棄去下層血細胞并分離獲得患者上層血漿。通過血漿游離DNA提取試劑盒分離獲得各樣本中總DNA,最終分離柱中總DNA溶解于洗脫緩沖液TB中并分裝在EP管中,置于-20 ℃冰箱中短期保存或直接用于后續DNA亞硫酸氫鹽修飾。

1.2.2SIM2、GNA12、CTG亞硫酸氫鹽修飾 所有提取的樣本DNA通過DNA甲基化修飾試劑盒(伯信生物有限公司,貨號:Bes5201)進行DNA亞硫酸氫鹽轉化、提純。嚴格參照說明書步驟進行,所有修飾后DNA置于EP管中并凍存于-80 ℃冰箱保存或直接用于后續甲基化DNA檢測。

1.2.3甲基化SIM2、GNA12、CTG檢測 通過Pubmed中NCBI軟件設計甲基化SIM2、GNA12、CTGF及內參基因GAPDH的引物,具體引物序列見表1,所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。取1 μL處理好的樣本甲基化DNA,加入TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL,對應甲基化DNA正、反向引物各1 μL并調整體系至20 μL,通過實時定量熒光PCR(qRT-PCR)擴增目的基因及內參基因,反應條件設置為:90 ℃ 1 min,95 ℃ 30 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,共循環40次。甲基化SIM2、GNA12、CTGF均以GAPDH作為內參,分別計算各樣本Ct值,并根據公式2-ΔΔCt計算出各樣本中目的基因相對表達水平。

表1 引物序列

2 結 果

2.1兩組血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平比較 觀察組血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平均高于對照組(P<0.05),見表2。

2.2不同嚴重程度子癇前期孕婦臨床特征及血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平比較 不同嚴重程度子癇前期孕婦年齡、BMI、孕周、既往有妊娠史比較差異無統計學意義(P>0.05),輕度子癇前期組血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平低于重度子癇前期組(P<0.05),見表3。

2.3血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平與孕婦子癇前期發生率的相關性 Spearman相關性分析表明,血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平與孕婦子癇前期發生率呈正相關(r=0.513、0.584、0.585,P<0.05)。

2.4血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF單獨及聯合預測孕婦子癇前期的ROC曲線分析 ROC曲線分析結果表明,血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF單獨及聯合預測孕婦子癇前期的效能均較高,三者聯合檢測的曲線下面積(AUC)大于各項單獨檢測及二者聯合檢測。見表4、圖1。

表2 兩組患者血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平比較

表3 不同嚴重程度子癇前期孕婦臨床特征及血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平比較或n(%)]

注:A為甲基化SIM2、GNA12、CTGF單獨檢測的ROC曲線,B為甲基化SIM2聯合甲基化GNA12、甲基化SIM2聯合甲基化CTGF、甲基化GNA12聯合甲基化CTGF、甲基化SIM2聯合甲基化GNA12聯合甲基化CTGF檢測的ROC曲線。

表4 血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF單獨及聯合預測孕婦子癇前期的效能

3 討 論

部分孕婦在妊娠期間可能發展為子癇前期,若不及時控制可能造成多臟器損害、胎兒宮內生長受限等不良結局,嚴重時甚至造成孕婦和胎兒死亡[8]。目前臨床對于子癇前期孕婦無特效治療手段,以終止妊娠作為主要治療方式[9]。因此,尋找早期預測、診斷子癇前期的方法是臨床亟需解決的問題。盡管已有大量關于子癇前期的臨床及基礎研究,但其發生發展的具體機制仍不明確。有研究認為,各種原因導致的胎盤缺氧缺血、孕婦機體氧化應激水平增高、體液及細胞免疫失衡、螺旋動脈畸形等均可能導致子癇前期的發生,而遺傳因素可能貫穿子癇前期病理生理機制的各個階段[10-12]。近幾年表觀遺傳學在子癇前期發生發展過程中扮演的角色逐漸受到人們關注,存在潛在相關性的表觀遺傳學修飾包括組蛋白修飾、非編碼RNA調控、染色質重構等,其中游離DNA甲基化相關研究逐漸成為子癇前期早期診斷和治療的新熱點[13-15]。這種在DNA甲基轉移酶介導下發生的CpG二核苷酸胞嘧啶甲基化過程往往會引起基因轉錄受到抑制或表型發生改變,目前已有多項研究認為子癇前期中相關功能基因表達異?？赡芘c基因不同位點甲基化有關[16-17]。

SIM2基因屬于堿性螺旋-環-螺旋家族,作為一種重要的轉錄相關調控因子,其在多種代謝相關生理及病理過程中發揮重要作用[18]。GNA12基因編碼的蛋白是一類具有跨膜信號監管作用的蛋白。以往研究發現,子癇前期患者GNA12蛋白表達水平較健康孕婦明顯升高,但關于甲基化GNA12基因水平是否也有差異尚不可知[19-20]。CTGF基因及其編碼的蛋白具有促進血管生成、細胞外基質重塑及細胞再生的功能,特別是在子癇前期孕婦及其胎兒血清中可發現CTGF轉錄水平明顯升高[21-22]。然而,關于此類基因甲基化與子癇前期發病的相關性的研究尚少。在本研究中,筆者發現發生子癇前期的孕婦血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平均明顯高于健康孕婦,且重度子癇前期孕婦各甲基化DNA相對表達水平更高(P<0.05)。相關性分析及ROC曲線分析結果表明,血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平獨立及聯合預測孕婦子癇前期的效能均較好,且三者聯合預測的效能最高(AUC=0.888,95%CI:0.827～0.949)。分析其原因,以往研究認為SIM2參與了胎盤早剝所致胎兒智力障礙的發生發展過程,這可能表明SIM2基因表達水平變化可能與血管生成異?；蛱ケP血管痙攣相關,當孕婦體內檢測到高水平的甲基化SIM2時,表明胎盤功能受到一定程度影響,進而可能誘導子癇前期的發生及胎兒臟器發育不成熟[23]。此外,以往研究發現,健康孕婦的胎盤細胞中SIM2甲基化相對表達水平并不高,這也提示SIM2可能只在甲基化后參與子癇前期的發生發展過程[24]。甲基化GNA12在子癇前期孕婦中相對表達水平較高可能是由于其作為醛固酮增多癥發病的候選基因之一參與調控子癇前期發生。有研究發現,GNA12基因啟動子上CpG63位點的甲基化率在子癇前期孕婦中高于未發生子癇前期的孕婦,進一步印證GNA12甲基化程度與子癇前期發生率的相關性[25]。而CTGF作為參與血管生成的重要調控基因,可能通過調控螺旋動脈血管重塑功能影響子癇前期的進展及嚴重程度[26]。當甲基化CTGF相對表達水平升高時,患者體內血管內皮細胞活性及增殖可能受到影響,導致胎盤血管、螺旋動脈血管等生成障礙或畸形,進而導致孕婦出現子癇前期。但關于上述基因參與并調控子癇前期發生發展的具體機制及作用仍需通過細胞生物學、動物模型等基礎實驗進一步探究。

本研究存在一定局限性。首先,由于僅在單中心進行病例對照研究,納入的樣本量相對較少,病例特征可能存在地域性的局限。其次,雖然筆者發現子癇前期孕婦血漿甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平存在變化,但僅代表了患者某一時間節點的橫斷面結果,這可能導致本研究結果與既往研究結論存在一定差異,后續筆者會以上述基因為潛在靶點,通過構建前瞻性隊列探究其與子癇前期發生的潛在機制。盡管如此,本研究發現相比于健康孕婦,子癇前期孕婦血漿中甲基化SIM2、GNA12、CTGF相對表達水平均較高,且與孕婦子癇前期的發生率呈正相關,聯合分析孕婦甲基化SIM2、GNA12及CTGF相對表達水平有望成為判斷子癇前期是否發生的重要指標。