核仁型抗核抗體在自身免疫性疾病中的臨床意義

丁聰聰,王 希,林 芳,于 樂,陳 慧,董 軻

空軍軍醫大學第二附屬醫院檢驗科,陜西西安 710038

抗核抗體(ANA)是一組將自身各種細胞成分作為靶抗原的自身抗體總稱。血液中存在高效價自身抗體是自身免疫性疾病(AID)的特點之一,也是臨床確診AID的重要依據,對判斷AID的活動程度、觀察治療效果、指導臨床用藥具有重要的臨床意義[1]。目前,間接免疫熒光法(IIF)作為ANA臨床檢測中最為常見的方法,被歐洲自身免疫標準化促進會(EASI)、美國風濕病學會(ACR)等專業學會推薦為ANA檢測的“金標準”[2-4]。2014年國際自身抗體和自身免疫研討會上,研究者對ANA HEp-2細胞間接免疫熒光染色模型命名形成了標準化國際共識[5],將核仁型ANA作為必報熒光模式。然而,目前國內外對于核仁型ANA熒光模式的臨床報道較少。對此,本研究就核仁型ANA的陽性率及其在相關疾病中的臨床意義進行了回顧性分析,并探討了其在AID診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究為回顧性研究。選擇2017年1月至2022年5月本院基本資料較全(性別、年齡、就診科室、臨床診斷等)的門診和住院的ANA常規檢測者71 780例(排除重復病例),其中男25 236例(35.15%),年齡1～98歲,平均年齡51.14歲;女46 544例(64.85%),年齡1～97歲,平均年齡41.66歲。對核仁型ANA陽性的患者,收集相關實驗室指征和臨床資料,包括臨床診斷、送檢科室、ANA特異性抗體譜、肝腎功能檢查結果等。本研究通過本院醫學倫理委員會批準(批準文號:TDLL-202207-04號)。

1.2儀器與試劑

1.2.1ANA檢測 ANA檢測采用德國歐蒙公司的IIF樣本及載片全自動操作儀,以及配套的間接免疫熒光試劑盒,載片以HEp-2細胞和猴肝組織冷凍切片為實驗基質。所有熒光顯微鏡判讀結果(ANA陰陽性、熒光模式、ANA滴度)初步判讀后,由另一位高年資(ANA檢測工作3年以上)檢驗技師進行核對確認。同時分別設置陰、陽性對照用于判斷實驗的有效性。

1.2.2核仁型ANA陽性的結果判讀 (1)HEp-2細胞:分裂間期細胞核核仁呈均勻熒光,可見弱的細顆粒狀熒光;分裂期細胞染色體無熒光,染色體以外的區域呈現細顆粒狀熒光,見圖1A。(2)猴肝組織冷凍切片:細胞核呈現弱的細顆粒狀或網狀熒光,核仁呈現均勻熒光。熒光強度弱于HEp-2細胞,見圖1B。(3)與核均質型ANA熒光模式鑒別要點:核均質型ANA在分裂間期細胞核均勻著染熒光,分裂期細胞染色體熒光增強,見圖1C。(4)與核顆粒型ANA熒光模式鑒別要點:核顆粒型ANA分裂間期核仁無熒光,核仁周圍點狀增強熒光,分裂期染色體周圍均勻熒光,見圖1D。

注:A為核仁型ANA在HEp-2細胞上的熒光染色模式;B為核仁型ANA在猴肝組織上的熒光染色模式;C為核均質型ANA在HEp-2細胞上的熒光染色模式;D為核顆粒型ANA在HEp-2細胞上的熒光染色模式。

1.2.3其他檢測 ANA特異性抗體譜檢測采用德國歐蒙醫學實驗診斷股份公司提供的免疫印跡法(LIA),包括以下15種特異性抗體:SS-A、SS-B、雙鏈DNA(dsDNA)、抗nRNP/Sm、Sm、核小體(Nukleosome)、Ro-52、增殖細胞核抗原(PCNA)、Jo-1、著絲點蛋白B(CENP B)、組蛋白(Histone)、核糖體(rRNP)、Scl-70、PM-Scl、線粒體-M2(AMA-M2)抗體。

生化試驗采用貝克曼AU5800全自動生化分析儀,生化試劑購自上海科華公司。類風濕因子(RF)檢測采用德國西門子公司BNII全自動特定蛋白儀和配套RF試劑。

2 結 果

2.116 778例ANA陽性者的熒光模式分析 在71 780例ANA常規檢測標本中,ANA陽性例數為16 778例,陽性率為23.37%。其中,單一熒光模式的有13 440例,包括核顆粒型[6 436例(38.36%)]、核均質型[2 728例(16.26%)]、核仁型[1 444例(8.61%)]、核膜型[287例(1.71%)]、核漿點型[708例(4.21%)]、胞漿顆粒型[1 573例(9.38%)]、胞漿纖維型[260例(1.55%)]、胞漿棒環狀型[3例(<0.01%)]、分離帶型[1例(<0.01%)];復合熒光模式(兩種核型及以上)有3 338例(19.90%)。

2.2ANA及核仁型ANA陽性情況 在71 780例ANA常規檢測標本中,ANA陽性為16 778例,陽性率為23.37%。其中核仁型ANA陽性為1 708例,占所有ANA常規檢測標本的2.38%(1 708/71 780),在ANA陽性者中的比例為10.18%(1 708/16 778)。16 778例ANA陽性者中不同年齡、性別組間的核仁型ANA陽性率比較見表1。其中,>20～<50歲組和≥50歲組中不同性別間核仁型ANA陽性率比較差異均有統計學意義(χ2=26.18、43.06,P均<0.01),≤20歲組中不同性別間核仁型ANA陽性率比較差異無統計學意義(χ2=3.43,P>0.05)。而在不同性別分布中,女性在不同年齡組(≤20歲組、>20～<50歲組和≥50歲組)間的核仁型ANA陽性率比較差異有統計學意義(χ2=9.14、P<0.05);男性在不同年齡組(≤20歲組、>20～<50歲組和≥50歲組)間的核仁型ANA陽性率比較差異無統計學意義(χ2=3.89、P>0.05)。男、女性在不同年齡組中的核仁型ANA陽性率均以>20～<50歲組為最高。

表1 16778例ANA陽性者不同性別、年齡組間核仁型ANA陽性率比較[%(n/n)]

2.3ANA及核仁型ANA在不同科室檢出情況 ANA陽性率前3位的科室分別為風濕免疫科(70.35%)、感染科(38.87%)和呼吸內科(35.63%)。在不同臨床科室的送檢者中,核仁型ANA陽性率組間比較差異有統計學意義(χ2=63 760.92,P<0.01),以風濕免疫科為最高(6.47%);在不同臨床科室ANA陽性者中,核仁型ANA陽性率以生殖醫學中心為最高(12.90%),組間比較差異有統計學意義(χ2=10 851.06,P<0.01)。見表2。

2.4核仁型ANA陽性在AID和非AID患者中的滴度分布 1 708例核仁型ANA陽性者中,有420例做了ANA滴度,包括34例AID患者(8.09%)和386例非AID患者(91.91%)。AID組中有44.12%核仁型滴度≥1∶320,中位數為1∶100;其中,系統性AID患者中核仁型ANA滴度以≥1∶320為主,占50.0%;器官性AID患者中核仁型ANA滴度以1∶100為主,占75.0%。而非AID組41.97%核仁型ANA滴度為1∶100,中位數為1∶320;AID組與非AID組核仁型ANA滴度比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 不同臨床科室組中核仁型ANA的陽性分布

表3 核仁型ANA陽性者在AID組和非AID組中的滴度分布[n(%)或n]

2.5核仁型ANA陽性的AID患者的臨床和實驗室特征 34例核仁型ANA陽性的AID患者,平均年齡40.3歲(中位數36.5歲),男女比例為2.4∶1(女/男),ANA特異性抗體譜以15項特異性抗體全陰為主(28/34,82.35%),34例中有12例是復合核型(35.29%),其中核仁型/核均質型3例,核仁型/核顆粒型3例,核仁型/胞漿顆粒型4例,核仁型/胞漿纖維型2例。核仁型ANA陽性的34例AID患者中,有6例為抗可溶性抗原(ENA)抗體陽性,其中,抗SSA陽性3例,Rib.p3例,M2 1例。34例核仁型ANA陽性的AID患者,存在不同程度的心肺相關疾病、關節痛/關節炎、肝腎功能異常的臨床表現,見表4。

表4 34例核仁型陽性的AID患者的臨床和實驗室特征(n)

3 討 論

ANA在大多數AID患者中均可呈陽性,如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、混合性結締組織病、干燥綜合征、硬皮病、慢性活動性肝炎,但ANA陽性并不一定提示患有AID,健康老年人也可有低滴度的ANA。各種ANA在不同類別AID患者中出現不同組合,可形成各種疾病或疾病亞群的特征性抗體譜。因此,總的ANA檢測在臨床診斷與鑒別診斷中是一個極為重要的篩查試驗,ANA陽性者進一步接受各亞類ANA抗體檢測對明確診斷、臨床分型、病情觀察、預后及治療評價都具有重要意義[6]。

針對IIF檢測ANA這一“金標準”,2014年第12屆自身抗體和自身免疫國際研討會期間達成了熒光模型國際共識(ICAP),提出了關于ANA熒光模式標準化分類、命名的第1個國際共識[7]。2019年ICAP明確了IIF檢測ANA不同熒光模式的臨床相關性[8]。典型的核仁型熒光模式被描述為分裂間期細胞核可見弱的細顆粒狀熒光,核仁呈均勻熒光;分裂期細胞染色體無熒光,染色體以外的區域呈現細顆粒狀熒光。

在本研究中,71 780例ANA常規檢測者中核仁型ANA陽性率為2.38%,核仁型作為ANA陽性眾多熒光模式中的一種,在16 778例ANA陽性者中的比例為10.18%,而周仁芳等[9]報道,致密細斑點型(DFS)在ANA陽性者中比例為8.79%,這也能說明核仁型是ANA陽性者中常見的熒光模式之一。本研究中,男性ANA陽性率為19.26%,女性ANA陽性率為25.60%,與此前研究分析健康人群男性女性ANA陽性率差異的結果基本一致[10]。而在ANA陽性人群中,男、女性核仁型ANA陽性率分別為13.08%、9.00%(P<0.05),雖然女性總體ANA陽性率較高,但核仁型ANA陽性率男性較高的原因可能與激素水平、免疫狀態有關,然而目前國內外鮮見相關文獻報道這方面的機制,有待后續研究進一步探索。

本研究結果顯示,女性在≤20歲組、>20～<50歲組和≥50歲組中核仁型ANA陽性率分別為6.11%、9.49%、8.40%,在>20～<50歲組中最高(P<0.05),核仁型ANA陽性率與雌激素變化幅度存在一定聯系,分析可能與激素抗原表位表達及受體數量發生變化有關,導致機體免疫系統識別功能發生障礙,這一結果與有關文獻報道基本相符[10-11]。上述結果表明ANA陽性者核型的不同可能與性別和年齡有關,具體機制尚待研究。

在不同臨床科室送檢者中,雖然ANA陽性率以風濕免疫科最高,但核仁型ANA陽性主要以呼吸內科、神經內科、生殖醫學中心等非風濕免疫科為主,且組間差異有統計學意義(P<0.01),表明ANA陽性者除常見的核型(如核均質型、核顆粒型及胞漿型等)外,還可出現核仁型及其他核型,這可能與近些年擴大ANA檢測的臨床應用有一定的關系。而核仁型作為近年來陽性率較高的ANA核型,在非風濕免疫科的患者中出現較多,提示核仁型ANA可能是AID的非特異性自身抗體。值得關注的是,本次回顧性研究中,ANA陽性者中核仁型ANA陽性率最高的科室是生殖醫學中心(12.90%),此前TICCONI等[12]發現,ANA在鑒別潛在的免疫異常的復發性妊娠損失(RPL)患者方面具有一定的價值。類似地,孫思等[13]的研究也證實了不明原因復發性妊娠損失(URPL)患者的預后與ANA陽性滴度有關。雖然目前還沒有完全明確RPL與ANA相關性的機制,但也為臨床診療提供了一個有參考意義的實驗室指標。

本研究中,進行ANA滴度試驗的420例核仁型ANA陽性者以患非AID為主,占91.90%,主要包括慢性腎病、慢性病毒性肝炎、系統性硬化癥、重癥肌無力等多種疾病;而AID患者僅有34例,占8.10%,主要包括結締組織病患者14例、系統性紅斑狼瘡6例、干燥綜合征3例和類風濕關節炎3例等。因此,ANA雖然是AID的特征性血清學標志,特別是在如系統性紅斑狼瘡中可作為疾病診斷的指標,但是熒光模式結果為核仁型ANA陽性主要出現在非AID患者中,提示熒光模式結果為核仁型ANA可能是AID的非特異性自身抗體,也表明在目前無數字成像系統自動判讀鑒別核仁型ANA的情況下,如何正確快速地鑒別核仁型的熒光模式,是臨床實驗室亟待解決的問題[14]。正確快速地鑒別ANA的熒光模式,有助于更好地服務臨床,減輕對AID患者的傷害,為臨床提供積極的輔助[15-16]。

另外,核仁型陽性滴度1∶320在非AID患者中的陽性率高于AID者;核仁型陽性滴度1∶100在AID患者中的陽性率高于非AID者;說明在非AID和AID患者中核仁型陽性滴度存在不同的滴度分布。核仁型ANA陽性的34例AID患者存在不同程度的心肺相關疾病、關節痛/關節炎、肝功能異常、RF、ANA特異性抗體譜等臨床表現和實驗室特征,而最具特征的是ANA特異性抗體譜中的15項特異性抗體大多為陰性(28/34,82.35%)。有文獻報道,含核仁型ANA的血清中常見的抗ENA抗體為抗SSA、抗SSB、抗Scl-70抗體,占抗ENA抗體陽性總數的90.29%[17],而在本研究核仁型ANA陽性的34例AID患者中,有6例為抗ENA抗體陽性,其中,SSA陽性3例,Rib.p3例,M2 1例,沒有發現文獻中常見的抗Scl-70抗體和PM-scl[18-20],分析可能與樣本納入范圍及地域差異有關。

臨床就診患者中核仁型ANA的陽性率在不同年齡、性別組間存在差異,不同類別AID疾病中核仁型ANA陽性率和滴度均存在差異。此外,ANA陽性患者核型呈現多樣性,特別是某些特殊核型(如核仁型)對AID的診斷具有重要臨床意義,但僅根據核型來判斷AID則有一定的片面性[21-23]。在分析結果時,應結合以下因素考慮:年齡、性別,效價的增長和波動情況,其他免疫學指標(如IgG、IgA、IgM和補體等)有無增高,病損部位有無淋巴細胞浸潤和免疫復合物沉積,對免疫抑制劑治療的反應,有無家族史,以及紅細胞沉降率有無加快等。