人群重金屬混合暴露與肝功能的關聯研究

趙拴政 殷國桓 趙梅朵 李 昂 吳景濤 柳曉琳 魏嵐萍 徐 晶* 許 群

(1.中國醫學科學院 基礎醫學研究所,北京協和醫學院 基礎學院 流行病與衛生統計學系,中國醫學科學院 環境與健康研究中心,北京 100005;2.錦州醫科大學,遼寧 錦州 121001;3.錦州市中心醫院,遼寧 錦州 121001)

肝病所致的全球疾病負擔仍然巨大,據研究,全球每年約有200萬人死于肝臟疾病,造成了嚴重的醫療經濟損失[1]。同樣,中國因肝病造成的壽命損失也有所上升[2]。研究表明,病菌、不良的生活習慣以及環境毒物等均可導致肝臟損傷,引發肝臟疾病[3]。肝臟作為人體的代謝器官,在對有毒化學物的代謝中起著關鍵作用[4]。而重金屬作為一種廣泛存在于土壤、水以及空氣中的環境持久性以及生物累積性污染物[5],多項流行病學研究報道了其對肝臟的損傷[6-8]。然而,這些研究的結果是不一致的,且評估肝臟損傷的肝功能指標較為單一。因此,本研究選取遼寧省一個典型的重金屬污染區居民作為研究對象,分析了5種重金屬鉻(Cr)、鎘(Cd)、釩(V)、錳(Mn)、鉛(Pb)與9種肝損傷標志物的關聯。此外,考慮到真實的情況往往是多金屬的共同暴露,本研究也同時評估了5種重金屬混合暴露對肝功能標志物的總體效應。

1 實驗部分

1.1 研究對象

研究對象來源于2016—2018年在遼寧省錦州市重金屬污染區進行的橫斷面調查。納入標準為:1)年齡≥18歲;2)在該地區居住10 a以上;3)無任何肝病,如脂肪肝、慢性肝炎或肝硬化;4)有完整的問卷和測量數據。本研究最終納入1 266人,所有參與者均由專業人員進行標準化問卷的調查與體檢,并收集了空腹血液樣本。所有的參與者均簽署了知情同意書,本研究方案(項目編號:2021025)已獲中國醫學科學院基礎醫學研究所機構倫理委員會批準。

1.2 調查內容

本研究通過標準化問卷進行調查,內容包括:年齡(連續型變量)、性別(男性或女性)、教育程度(小學及以下,初中及以上)、職業(農民或其他)、家庭年收入(<2 000元或≥2 000元)、吸煙狀態(是或否)、飲酒狀態(是或否)等。

1.2.2 體格檢查

通過體格檢查收集了參與者的體重、身高等信息,并計算了體質質量指數(Body mass index,BMI)=體重/身高2。

1.3 血液金屬檢測

空腹血樣由臨床專業人員在檢查當天收集于無金屬肝素抗凝管(BD Biosciences,CA,USA)中,并保存于-80 ℃冰箱中。采用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS;Thermo Fisher X2;Thermo Fisher Scientific)來測量血液中Cr、Cd、V、Mn和Pb的水平。為便于進行后續的統計分析,對于金屬水平低于檢出限(Limit of detection,LOD),則以LOD/2替代。

1.4 肝功能標志物的檢測

早期肝損傷生物標志物丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、天冬氨酸轉氨酶與丙氨酸轉氨酶之比(AST/ALT)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白蛋白與球蛋白之比(ALB/GLB)、總蛋白(TP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)使用自動生化分析儀(Hitachi 7600)檢測。

1.5 質量控制

所有調查人員在調查開始前都接受了統一規范化的培訓,調查數據也均采用雙人錄入,以確保一致性與準確性。血樣金屬的檢測采用盲法和質控樣本以確保檢測質量。在分析樣本之前,以空白溶液來確定背景值,進行加標回收實驗,測試元素的峰值回收率在93.9%～102%,批內和批間的精度值分別為<5%和<10%。

1.6 統計學分析

分類變量數據采用數量(百分比)表示,連續型數據根據是否符合正態分布采用均數(標準差)或中位數[第一分位數(P25),第三分位數(P75)]表示。由于金屬值的右偏態分布,本研究進行了對數轉換以更好地擬合模型。此外,采用Spearman秩相關計算了5種金屬之間的相關性。

王維說：“我心素已閑，清川澹如此。”所以，他能夠領略自然中“明月松間照，清泉石上流”、“人閑桂花落，夜靜春山空”的清幽空靈。

1.6.1 一般線性回歸

首先以單個重金屬濃度作為暴露變量,以每個肝功能生物標志物作為連續型結果變量,使用一般線性回歸模型(General linear regression model,GLM)評估單一重金屬暴露與肝功能生物標志物之間的關聯。

1.6.2 加權分位數和回歸

為了探討5種重金屬共同暴露對肝功能標志物的總體影響,以及每種金屬在總體影響中的貢獻占比,本研究使用了加權分位數和(Weighted quantile sum,WQS)回歸,WQS模型用于評價混合物的總體效應及每個暴露變量重要程度。其默認假設所有暴露變量與結局關聯為同一方向(正向或負向),當將WQS指數納入多元回歸模型時,相關效應估計代表總體混合效應,權重代表各金屬在整體混合物中的相對貢獻[9]。

1.6.3 Quantile g-computation

由于WQS模型需要預先確定相關的方向,當單一暴露和結果同時具有不同的相關方向時存在局限性,本研究同時使用了Quantile g-computation模型以彌補WQS模型關聯方向選擇的不足以及驗證上述GLM與WQS的結果。Quantile g-computation模型不要求所有暴露都與結果均呈同一方向的相關。其可將金屬濃度轉換為四分位數,并擬合一個線性模型,從而得到總體效應,并同時輸出每種金屬在總體影響中的貢獻占比[10]。如果5種金屬的影響有不同的方向,其提供了每種金屬的正或負權重值,正或負權重值之和為1或-1。

變量的描述性分析與GLM模型采用SAS 9.4(Cary,NC,USA)完成,WQS模型與Quantile g-computation模型使用了R(version 4.0.5)軟件的“gWQS(version 3.0.4)”和 “qgcomp(version 2.10.1)”包。所有模型均對性別、年齡、BMI、教育程度、吸煙、飲酒狀態、職業以及家庭年收入進行了調整。雙側檢驗P<0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 基本情況

1 266名研究對象的年齡為(65.5±10.5)歲,BMI為24.26±3.78,女性占比(64.6%)多于男性;多數人不吸煙(65.9%)或飲酒(73.2%),且職業多為農民(89.7%);教育程度多為小學及以下(92.7%),多數人(56.8%)家庭年收入≥2 000元。血液金屬及肝功能標志物的濃度描述見表1。5種金屬之間存在低到中度的相關性(0.04～0.29)。

表1 研究人群的基本特征(n=1 266)

2.2 單一金屬與肝功能標志物的關系

由GLM的結果可知,經對數轉換后的血重金屬Cr、Cd、V、Mn的濃度每增加1個單位,AST/ALT水平分別平均升高1.59、2.86、11.83和5.28(βCr=1.59,95%CI:0.46、2.72;βCd=2.86,95%CI:1.30、4.42;βv=11.83,95%CI:7.87、15.78;βMn=5.28,95%CI:2.86、7.71);對數轉換后的血重金屬Cr、Cd、Mn、Pb水平每增加1個單位,ALB水平分別平均降低0.72、1.12、1.60和0.77 g/L(βCr=-0.72,95%CI:-1.04、-0.41;βCd=-1.12,95%CI:-1.56、-0.69;βMn=-1.60,95%CI:-2.28、-0.92;βPb=-0.77,95%CI:-1.44、-0.11);對數轉換后的血重金屬Cr、V水平每增加一個單位,GLB水平分別平均升高0.43和1.73 g/L(βCr=0.43,95%CI:0.21、0.65;βV=1.73,95%CI:0.95、2.50);對數轉換后的血重金屬Cr、Mn水平每增加1個單位,ALB/GLB水平平均降低1.42和1.48(βCr=-1.42,95%CI:-1.87、-0.97;βMn=-1.48,95%CI:-2.47、-0.50);經對數轉換后的血重金屬Cr、Cd、Mn、Pb水平每增加1個單位,TP水平平均降低0.32、1.17、1.48和0.81 g/L(βCr=-0.32,95%CI:-0.65、-0.01;βCd=-1.17,95%CI:-1.63、-0.72;βMn=-1.48,95%CI:-2.19、-0.77;βPb=-0.81,95%CI:-1.51、-0.12);經對數轉換后的血重金屬Cd、V、Mn水平每增加1個單位,TBIL水平分別平均升高0.59、2.70和1.01 μmol/L(βCd=0.59,95%CI:0.00、1.18;βV=2.70,95%CI:1.19、4.20;βMn=1.01,95%CI:0.09、1.94);經對數轉換后的血重金屬Cr、Cd、V、Mn、Pb水平每增加1個單位,DBIL水平分別平均升高0.08、0.07、0.13、0.10和0.06 μmol/L(βCr=0.08,95%CI:0.05、0.10;βCd=0.07,95%CI:0.04、0.11;βV=0.13,95%CI:0.04、0.22;βMn=0.10,95%CI:0.05、0.16;βPb=0.06,95%CI:0.01、0.12)。詳見表2。

表2 一般線性回歸模型中單一重金屬與肝功能標志物的關聯(n=1266)

2.3 混合金屬暴露與肝功能標志物的關聯及每種金屬在混合效應中的貢獻占比

2.3.1 加權分位數和(WQS)回歸的結果

如圖1所示,WQS指數每增加一個分位數,AST/ALT水平平均升高4.42(β=4.42,95%CI:2.66、6.18)、GLB水平平均升高0.52 g/L(β=0.52,95%CI:0.21、0.83)、TBIL水平平均升高1.33 μmol/L(β=1.33,95%CI:0.70、1.96)、DBIL水平平均升高0.31 μmol/L(β=0.31,95%CI:0.04、0.58),而ALB水平平均降低1.93 g/L(β=-1.93,95%CI:-2.54、-1.32)、ALB/GLB水平平均降低1.36(β=-1.36,95%CI:-1.99、-0.73)、TP水平平均降低1.47 g/L(β=-1.47,95%CI:-2.08、-0.86)。其中,V在金屬混合暴露對AST/ALT(Weight=0.43)、GLB(Weight=0.52)、TBIL(Weight=0.48)的正向關聯中有最大的權重,而Cr在對DBIL(Weight=0.34)的正向關聯中權重最大。Mn、Cr、Cd分別在金屬混合暴露對ALB(Weight=0.52)、ALB/GLB(Weight=0.58)、TP(Weight=0.47)的負向關聯中權重最大。

圖1 加權分位數和(WQS)回歸中重金屬混合暴露與肝功能標志物的關聯及每種重金屬的權重(n=1266)Figure 1 The association between mixed heavy metal exposure and liver function biomarkers in weighted quantile sum(WQS) regression and weights of each heavy metal(n=1266).

2.3.2 Quantile g-computation模型的結果

Quantile g-computation模型的結果基本一致于GLM與WQS的結果。如表3及圖2所示,經對數轉換后的5種重金屬水平同時增加1個分位數,AST/ALT水平平均升高4.70(β=4.70,95%CI:2.86、6.55)、GLB水平平均升高0.32 g/L(β=0.32,95%CI:0.04、0.60)、TBIL水平平均升高0.97 μmol/L(β=0.97,95%CI:0.26、1.68)、DBIL水平平均升高0.23 μmol/L(β=0.23,95%CI:0.05、0.42),而ALB水平平均降低1.76 g/L(β=-1.76,95%CI:-2.29、-1.24)、TP水平平均降低1.41 g/L(β=-1.41,95%CI:-1.95、-0.87)。而Cr在混合金屬對GLB(Weight=0.57)、ALB/GLB(Weight=-0.65)中有最大的權重;Cd在GLB(Weight=-0.73)、ALB/GLB(Weight=0.56)、TP(Weight=-0.41)中權重最大;V在AST/ALT(Weight=0.40)、TP(Weight=1)、TBIL(Weight=0.44)中權重最大;Mn在ALB(Weight=-0.34)、DBIL(Weight=0.43)中權重最大;而Pb分別在AST/ALT(Weight=-1)、TBIL(Weight=-0.55)中占有最大的負向權重。

圖2 Quantile g-computation模型中每種金屬在混合暴露與肝功能標志物關聯中的權重Figure 2 Weights of each metal in combined effect on liver function biomarkers in the Quantile g-computation model.

表3 Quantile g-computation模型中重金屬混合暴露與肝功能標志物的關聯以及每種重金屬的權重(n=1266)

3 討論

本研究揭示了5種重金屬(Cr、Cd、V、Mn、Pb)的單一和混合暴露與肝功能標志物(ALT、AST、AST/ALT、ALB、GLB、ALB/GLB、TP、TBIL、DBIL)之間的關聯。結果表明,5種重金屬混合暴露均能夠影響肝功能標志物,且重金屬V、Cr、Cd貢獻占比最大。提示重金屬暴露可能會造成肝臟損傷,V、Cr、Cd等可能對此影響最大。本研究為血金屬與肝功能之間的關系提供了證據,具有重要的公共衛生意義。

肝功能指標檢測可用于判斷肝臟是否損傷,評估損傷程度,確定受損位置以及幫助鑒別診斷。當肝細胞受損時,ALT、AST被釋放到細胞外,從而導致血清中水平升高[11];本研究觀察到重金屬與AST/ALT的正向關聯,LI等[12]對2011-2018年的NHANES數據研究同樣發現了重金屬Cd與AST/ALT的正向關聯,這與本研究的結果一致。TP、ALB由肝臟合成,當肝細胞受損時,二者水平下降[13];來自印度和巴基斯坦的兩項Cr職業暴露人群的肝毒性研究報告顯示,與對照組相比,Cr暴露人群的TP水平明顯較低[14-15];此外,一項在中國人群中探討Cd暴露對肝腎功能影響的橫斷面研究發現了Cd暴露與ALB水平的負向關聯[16];最近的一項對中國浙江省807名一般人群進行的橫斷面研究表明,Cr與Pb暴露也均與TP、ALB水平呈負向關聯[17]。同樣,本研究也發現了重金屬Cr、Pb、Cd等與TP、ALB的負向關聯。GLB作為人體的一種血清蛋白,常被用于肝功能損害的敏感指標,診斷肝臟疾病[18]。而TBIL、DBIL通常用于鑒別肝膽疾病和溶血性疾病[19]。本研究發現了重金屬與GLB、TBIL、DBIL存在正向關聯。一項對NHANES數據的研究同樣觀察到重金屬Pb與TBIL的正向關聯[12]。然而,在中國浙江省開展的橫斷面研究觀察到Cr、Pb分別與TBIL、DBIL呈負向關聯[17],這與本研究觀察到二者正向關聯的結果不同,不一致的原因可能為:首先,前人研究采用的金屬介質為尿液、而考慮到血金屬更能反映體內的重金屬負荷[20],本研究采用血液作為金屬介質,生物介質的不同可能是結果不一致的主要原因;其次,前人研究選取的人群來源于中國國家人體生物監測中心的一般暴露人群,而本研究人群來源于重金屬污染區,金屬暴露水平的不同也可能導致結果的不同。此外,多項動物學研究同樣觀察到了重金屬暴露與肝功能損傷的關聯。對Wistar大鼠進行的幾項重金屬暴露實驗發現,與對照組相比,Cr暴露組的TP水平下降[21]、Cd處理組ALB水平降低、Mn處理組的GLB水平顯著升高[22]。

重金屬廣泛存在于環境中,且存在較長的半衰期[5]。機制學研究表明,重金屬一旦被吸收,則會在肝、腎、骨骼等沉積,并通過氧化應激、DNA損傷等使人體造成嚴重損傷[23-24]。而當人體同時遭受多金屬的共同暴露時,可能產生更為復雜的效應。兩項關于小鼠的重金屬混合暴露實驗表明,小鼠同時暴露于Pb、Cd等金屬,其血清ALT、AST水平顯著高于對照及單金屬處理組[25-26]。這提示我們更應該關注多金屬的共同暴露。本研究發現多金屬混合暴露與肝功能標志物ALB、TP呈負向關聯,與TBIL、DBIL呈正向關聯。此外,多項橫斷面研究同樣觀察到Cr、Cd、Pb等金屬混合暴露與ALB、TP水平的負向關聯,與TBIL、DBIL的正向關聯[12,17,27]。這與本研究的結果一致。

4 結論

本研究擁有一些優勢:1)采用了9種肝功能標志物來評價重金屬對肝臟的影響,能更全面地評估肝臟損傷;2)探討了5種金屬對肝臟的影響,并同時使用了WQS與Quantile g-computation模型研究混合金屬暴露對肝臟產生的總體效應,使結果更具可信性;3)本研究的金屬來源于血液樣本,其不受稀釋度等因素的影響,檢測的金屬水平更為穩定。當然,本研究也存在一些局限性:1)研究為橫斷面研究,僅能提供關聯的方向,而不能說明因果;2)研究雖針對許多因素進行了調整,但可能仍存在未收集的混雜因素,如飲食;3)本研究未區分金屬的價態,例如Cr3+可能有益于人體,而Cr6+則是有害的。

綜上所述,本研究為重金屬與肝功能損傷之間的關系提供了證據,后續需進一步開展縱向研究來證明此種關聯,這可能對識別肝病的非傳統危險因素有重要意義。