基因功能驗證方法及研究進展

雷 華,趙廣展,林志藝*

(1.福建農林大學林學院/生態公益林重大有害生物防控福建省高校重點實驗室,福州 350002;2.福建省閩侯縣廷坪鄉林業站,福建 閩侯 350104 )

目前,基因研究方向已由結構研究轉向功能研究,在探索早期中,Thomopsson創建的ES細胞基因敲除小鼠模型,為基因敲除技術奠定了基礎[1]。近幾年來,出現了許多基因功能驗證方法,如基因敲除技術、ZFN技術、TALEN技術、RNA干擾等,這些方法被廣泛運用于植物、動物、細菌等生物群中。上述技術極大縮短了基因功能驗證所需要的時間,且這些方法的作用機制具有較高的特異性。對基因功能的深入研究有助于推進醫學、植物學和昆蟲學等領域的發展,探究其發展具有重要的意義。

1 基因敲除技術

基因敲除技術是目前研究基因功能最直接和最有效的方法之一,主要分為傳統基因敲除技術和新興基因敲除技術。傳統基因敲除技術依靠細胞內自然發生的同源染色體的隨機交換或者大規模隨機插入突變來達到基因敲除的目的,如同源重組技術、T-DNA插入突變技術和轉座子插入突變技術等[2]。新興基因敲除技術為可控的定點敲除,如ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9技術等,這些技術在基因敲除的效率方面有所提高,為基因功能驗證提供了新的途徑[2]。

1.1 同源重組

利用已知序列及功能的DNA片段與目的基因發生同源重組來改變生物的遺傳基因,使得目的基因功能表達被中斷,進而觀察生物形態和行為的變化,推測出目的基因在生物學上的功能[2]。該技術由于生物體內自發的同源染色體隨機交換效率極其低下,以至于實際操作量大,限制了其發展[2]。

目前,在小鼠研究中已具有的完備胚胎干細胞系統以及可行胚胎重建技術,因此,該技術廣泛運用于小鼠基因敲除模型的構建。但由于這兩項技術的發展速度緩慢,導致該技術并未運用于眾多大動物。且隨著新基因編輯技術(ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9等)的出現,更多的基因敲除模型不僅僅局限于該技術,如基因修飾兔的構建[3]、糖原貯積癥0型斑馬魚疾病模型的構建[4]、FOXN1基因敲除豬模型的構建[5]。

1.2 插入突變

1.2.1 T-DNA插入突變 通過農桿菌T-DNA介導的轉化將目的基因的DNA序列整合到基因組DNA上。該技術能便捷地進行正反向的遺傳學研究,但其具有較強的限制性,主要是由于植物的生物學、遺傳學特性及T-DNA標簽載體的不完善,使該技術僅能運用于少數模式植物[6]。

近年來,在擬南芥與水稻的研究中廣泛運用[7],在擬南芥基因組中已有超過225000個T-DNA插入系,已知超過88000個T-DNA插入的精確位置,且已鑒定了大約29454個預測擬南芥基因中的21700的突變[8]。在水稻的基因組中已有至少200000的T-DNA插入系,也已經產生了用于反向遺傳學方法的標記系[9]。

1.2.2 轉座子插入突變 轉座子是一類可移動遺傳因子,可引發基因重組和變異,該技術利用插入轉座子來產生易于識別的突變[10]。目前,高通量DNA測序與轉座子插入突變相結合形成轉座子插入測序(TIS)。TIS迄今為止運用對象多為細菌物種,不僅解決與細菌基因相關的基本問題,還證明了細菌在眾多人類疾病中起著主要作用。另外有一些相似于TIS的方法已開發運用于哺乳動物,真菌,寄生蟲和古菌[11]。如通過PB轉座系統成功地將轉錄因子導入小鼠和人的成纖維細胞, 并產生了穩定的iPS細胞[12],Zhu等人基于PB轉座系統篩選出畢赤酵母的3個碳源代謝阻遏基因以及126個可能參與甲醇利用途徑的功能基因[13]。TIS技術的發明擴展了以往轉座子插入突變目標的局限,可見該技術具有著巨大的發展潛力和用途。

1.3 靶向核酸酶介導基因編輯技術

1.3.1 ZFN靶向基因敲除技術 鋅指核酸酶(ZFN)是由鋅指蛋白結構域與FokⅠ切割結構域融合而成的人工核酸酶。當兩個ZFN單體各自與目標位點特異性結合且在DNA雙鏈的距離和方向符合一定要求時,FokⅠ能夠形成二聚體的活性形式,從而切割兩個結合位點的間隔區,產生DNA雙鏈切口,再利用細胞本身的同源重組或非同源末端連接修復機制進行切口修復,最終便可以達到基因敲除的目的[14]。

ZFN技術已成功應用在植物中的基因組修飾,且在果蠅、秀麗隱桿線蟲和斑馬魚中已有研究。目前,還運用于小鼠研究中,對比于誘變與轉座子插入突變而言,其特異性較強,工作量也更小[15]。但由于其特異性結合到不同的基因序列的過程需要較大的鋅指蛋白,而鋅指蛋白連接在一起時會相互干擾,導致容易出現脫靶的現象。因此,ZFN技術還具有較大的進步空間,如何降低其脫靶率是該技術重點突破方向。

1.3.2 TALEN靶向基因敲除技術 TALEN是由TALE與FokⅠ構成。它與ZFN相比,其識別序列不受位點上下游序列影響是作為第二代基因敲除技術的一個突出特點,但其作用原理與ZFN大致相同。其中,TALE蛋白是通常由串聯的33～35個氨基酸組成,其除了第12、13個氨基酸位置高度可變(RVD)外,其他重復序列高度保守。因此在TALEN技術中RVD就起到了堿基特異性識別的功能。而FokⅠ核酸內切酶則負責制造出切口,誘導DNA修復[16]。

該技術在成功應用于酵母后,便迅速運用在植物、人類細胞、小鼠、斑馬魚等研究中。如Y Tatsumi等通過TALEN介導的誘變獲得了2種rspo2斑馬魚突變體,一種是缺乏所有功能結構域的空突變體,另一種是缺乏兩個N末端結構域的亞態突變體,這兩個突變體的獲取有助于識別rspo2在骨骼發育過程中的作用[17]。Wang等通過TALEN介導的基因編輯破壞了小鼠的兩個Y連鎖基因(Sry和Uty),促進了對Y染色體基因功能的研究[18]。Wu等采用TALEN技術對豬的Tiki1進行定點修飾,成功構建了豬Tiki1敲除的大動物模型,為實現大動物高效的基因編輯提供了一定的技術基礎[19]。此外,TALEN技術顯著的缺點就是其模塊組裝的過程極其復雜,且具有一定的毒性。

1.3.3 CRISPR-Cas9基因敲除技術 CRISPR-Cas9技術是基于細菌與古生菌免疫防御機制所開發出的基因敲除技術。其使用被sgRNA激活的Cas9蛋白進行雙鏈DNA位點切割,再由低保真度的修復使位點突變失活[20]。

ZFN與TALEN技術作為第一代和第二代技術,存在著識別率低、成本高、脫靶率高、設計復雜等缺點,相比之下,作為第三代基因敲除技術的CRISPR-Cas9技術只需要可編程RNA即可產生序列特異性,因此其更為方便,制作更為簡單,脫靶率也有所降低。Zhou等通過胚胎共顯微注射Cas9-mRNA和靶向小鼠B2m,Il2rg,Prf1,Prkdc和Rag1的多種sgRNA產生了不同種類的免疫缺陷小鼠品系[21]。Zhang等實現了用CRISPR-Cas9系統把人的293T細胞的PVALB、EMX1基因、小鼠的Th基因定點突變。CRISPR-Cas9系統也被證明在根莖農桿菌轉化后的番茄毛根中起作用,并且是甜橙的第一個基因組編輯平臺[22]。CRISPR-Cas9系統一出世便引起了一系列基因編輯熱潮,直到現在仍未止步,相信伴隨著眾多對CRISPR-Cas9系統的改良運用,該技術將在基因功能驗證的發展上繼續發揮著巨大的作用。

2 RNA干擾技術

RNA干擾技術利用生物對未知病毒侵害、外源基因的固有防御機制,使用與靶基因序列具有同源性的雙鏈RNA引發高效且具有特異性的對應mRNA降解的技術,屬于轉錄后水平基因沉默[23]。由于siRNA與靶標mRNA的結合嚴格遵循堿基互補配對原則,因此具有極強的特異性,且其操作簡單,周期短,抑制作用明顯,在大量基因未知功能的驗證上具有著極大的運用前景。在植物、秀麗隱桿線蟲、果蠅等生物群中已有較為突出的成果,如Kamath等人已通過RNA干擾預測了秀麗隱桿線蟲19427個基因中86%的功能[24]。Dietzl等人通過RNA干擾與二元GAL4/UAS系統生成了22270個轉基因系,覆蓋了果蠅88%的預測蛋白質編碼基因[25]。另外,其作為遺傳工具已廣泛運用于哺乳動物的研究中,Beth Shafer等運用長dsRNA成功沉默了小鼠細胞的部分基因表達[26]。然而,在近年來在原核生物的研究中也發現了其存在RNA干擾機制,Man等人建立了atsRNA篩選模型,為研究原核生物的基因表達提供了一種新的工具[27]。

3 基因過表達技術

基因過表達技術是將目的基因的編碼區構建到載體上,后導入細胞達到目的基因過量表達,從而觀察表型分析目的基因的功能的技術。其中最重要的就是載體的構建,可以分為非病毒表達載體和病毒表達載體。由于選擇不同的基因表達載體會影響到目的基因在細胞內的轉染效率與穩定表達,所以在設計實驗時,載體的選擇需要慎重考慮[28]。

作為技術最成熟的基因功能驗證技術之一,近年來在動植物生物群中運用較為廣泛。Sun等構建了向日葵HaACO1的表達載體進行過表達分析,證明了其與植物耐鹽性有關[29]。Zhou等對芝麻SiSAD基因進行了克隆與過表達分析,探究了其在油酸合成過程中的作用[30]。Jia等利用過表達技術建立了豬GHR基因顯負性突變體的慢病毒載體,為后續研究相關基因功能筑造了基石[31]。在飛速發展的分子生物學時代,技術所展示的效率顯得尤為重要,在今后的使用過程中,需要更為注重表達載體的構建,選擇合適的啟動子、增強子、多聚腺苷酸信號等元件,都能夠提高目的基因在功能上的表達效率。

4 微陣列分析

微陣列分析是Schena等人首次開發的一種高通量檢測基因表達的系統,是生物學發展史上的一座里程碑[32]。現今依據不同的作用對象,被分為DNA微陣列、蛋白質微陣列、染色體微陣列、組織微陣列等。微陣列具有體積微小、成本較低、分析快且可多個樣品同時進行實驗等優勢,大大提高了基因功能驗證的效率。近幾年來,微陣列分析大量地運用于醫療疾病方面的基因功能檢測,如Tian等利用DNA微陣列檢測方法實現了對流感病毒的分類,簡化了診斷程序[33]。Wang等運用染色體微陣列分析表明了胎兒染色體非整倍體的發生率與年齡密切相關,而染色體拷貝數變異發生率與年齡無關[34]。He等結合蛋白微陣列分析得出WNT5A和COL1A1可能在軟骨損傷中起重要作用[35]。在使用過程中,蛋白質類微陣列雖然比DNA微陣列更為復雜,操作難度更大,但蛋白質作為基因最終表達的代表產物,其更加全面地反映基因的本質性功能。因此,改良蛋白質類微陣列分析方法對于微陣列分析的發展具有一定的重要性[36]。

5 基因誘捕技術

基因誘捕技術是一種將誘捕載體和小鼠胚胎干細胞(ES細胞)所結合的高通量基因突變方法。與傳統的僅依靠生物體內同源重組突變基因相比,使用基因誘捕的無啟動子基因誘捕載體的同源重組效率高了50%[37]。

該方法具有簡單性和高效性,近幾年來,主要運用于小鼠、斑馬魚、擬南芥。Kawakami提出了使用Tol2轉座元件在斑馬魚中進行基因捕獲的方法,為研究脊椎動物發育提供了新的思路[38]。Patricia通過基因誘捕證明了擬南芥中PRL與啟動DNA復制的MCM2-3-4酵母基因家族相關[39]。David等使用基因誘捕技術證明了小鼠活力、生長和肺發育與Sulf2基因有關[40]。目前該技術主要受限的原因是使用范圍較小,只能夠去除ES細胞表達的基因,在近年來常與其他技術結合使用。

6 結論與展望

在生命科學爆炸式發展的時代,作為探究生命本質不可或缺的基因功能驗證領域受到了更多的關注,其研究方法多種多樣,各種技術也都具有著獨特的優勢。但目前看來,仍然存在著特異性不足,使用效率不高、脫靶率較高、通用性不強等問題,這些研究瓶頸仍需要我們對其分子機制進一步研究來打破,發展出更為高效的基因功能驗證方法。盡管如此,現今的基因功能研究已在醫療、病蟲害防治、改良作物等領域展露出不可替代的作用。同時,隨著科學家們的不斷探求,基因功能驗證技術正在不斷地被完善走向成熟,相信在今后的時代里,基因功能驗證能夠爆發出更多不可取代的價值。