昆布多糖通過ERK通路對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位病灶及血管新生的抑制作用*

趙哲君,閆 霜,年衛(wèi)紅,陳雁南

(1.河南省榮軍醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南 新鄉(xiāng) 453003; 2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科,河南 鄭州 450052)

子宮內(nèi)膜異位癥是臨床常見的婦科疾病,多見于育齡期女性,臨床表現(xiàn)為下腹墜痛、痛經(jīng)、經(jīng)期紊亂、不孕等[1]。目前臨床對子宮內(nèi)膜異位癥尚無標準治療方式,多采用抗炎、止痛藥物配合抗雌激素藥物,通過降低炎癥反應(yīng)、抑制血管生成來緩解疼痛,但長期服用會導(dǎo)致子宮萎縮且存在停藥復(fù)發(fā)現(xiàn)象[2]。中醫(yī)學(xué)認為子宮內(nèi)膜異位癥的病機以瘀血內(nèi)停、腎虛血瘀為主,治療宜以活血化瘀、補腎利水為主。昆布取自海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布的干燥葉片,可消痰軟堅散結(jié),利水消腫,常被用于生殖系統(tǒng)疾病的治療。昆布多糖(laminarin,LA)提取自昆布,是一種天然海洋生物多糖,具有抗炎、抗病毒、降血壓、降血脂、保護血管等多種生物醫(yī)學(xué)功能[3]。研究[4]表明,LA可通過抑制一氧化氮生成、抑制炎癥刺激下的腦血管內(nèi)皮細胞增殖治療大鼠化膿性腦膜炎,推測其可對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生影響。本研究通過建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型,探究LA對其異位病灶及血管新生的抑制作用,并探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

無特定病原體級SD大鼠45只,雌性,7周齡,體質(zhì)量(200±10)g,購自北京安凱毅博生物技術(shù)有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證編號為SCXK(京)2017-0006,動物質(zhì)量合格證號為2019A035。實驗場所的使用許可證編號為SYXK(豫)2021-0013。

1.2 藥品、試劑與儀器

LA,純度99%,上海谷研實業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號9008-22-4;細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路激動劑表皮細胞生長因子(epidermal growth factor, EGF),美國默克公司產(chǎn)品,批號62229-50-9;免疫組織化學(xué)染色試劑盒,上海一基實業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號YJ1012608;血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品,批號PKSM041180;兔抗大鼠CD31、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷酸化p38 MAPK(phospho-p38 MAPK, p-p38 MAPK)、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2,p-ERK1/2)一抗,均為美國艾博抗公司產(chǎn)品,批號依次為ab9498、ab221012、ab284564、ab176640。BX53M顯微鏡,日本奧林巴斯株式會社產(chǎn)品;680酶標儀、GelDoc go凝膠成像分析系統(tǒng),均為美國伯樂公司產(chǎn)品;DYY-16D電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立與分組

參照參考文獻[5],采用自體移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型。取45只SD大鼠,術(shù)前2 d灌胃戊酸雌二醇0.5 μg/g使其統(tǒng)一處于發(fā)情期。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,固定大鼠于手術(shù)臺;下腹正中切口,分離左側(cè)子宮;結(jié)扎子宮兩端并切取中間一段子宮,置于無菌磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)中,分離出子宮內(nèi)膜,迅速貼于右側(cè)內(nèi)腹壁,用可吸收線固定兩端;逐層縫合切口并關(guān)腹。術(shù)后將大鼠置于干凈鼠籠保溫至蘇醒,肌肉注射青霉素3萬U/只預(yù)防感染,1次/d,持續(xù)3 d。隨機選擇10只大鼠設(shè)為假手術(shù)組,不切取子宮,不進行子宮內(nèi)膜移植,其余操作同前。術(shù)后6周開腹,異位內(nèi)膜生長為扁球體囊狀物,內(nèi)部充滿液體,表面可見清晰血管,即為造模成功。32只大鼠造模成功,隨機分為模型組11只、昆布多糖組11只、激動劑組10只。采用游標卡尺測量各組大鼠異位病灶的長、寬、高,計算異位病灶的體積,記為V前。體積測量完成后用青霉素粉撒于切口處預(yù)防感染,常規(guī)關(guān)腹。

1.4 干預(yù)方法

造模成功24 h后,參照參考文獻[6]對各組大鼠進行干預(yù)。激動劑組灌胃500 μg/g LA混懸液(生理鹽水配制),灌胃體積10 μL/g,2 h后尾靜脈注射10 ng/g EGF溶液;昆布多糖組灌胃500 μg/g LA混懸液,灌胃體積10 μL/g,1次/d;假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水10 μL/g體質(zhì)量,1次/d。各組均連續(xù)干預(yù)7 d。

1.5 檢測指標

末次干預(yù)后次日,腹腔注射戊巴比妥鈉,開腹,觀察異位內(nèi)膜生長情況,測量體積并記為V后。測量后脫頸處死大鼠,腹腔注射生理鹽水3 mL,灌洗腹腔;收集灌洗液,以離心半徑8 cm、轉(zhuǎn)速2 000 r/min冰上離心10 min;收集上清液置于4 ℃保存用于ELISA實驗。切取部分異位子宮內(nèi)膜組織(假手術(shù)組取在位子宮),分成2份。1份經(jīng)質(zhì)量分數(shù)40 g/L 聚甲醛固定24 h,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片,進行免疫組織化學(xué)染色及蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色;1份在液氮中保存,用于蛋白質(zhì)印跡實驗。

1.5.1 子宮內(nèi)膜生長抑制率

按以下公式計算子宮內(nèi)膜生長抑制率。子宮內(nèi)膜生長抑制率=(V前-V后)/V前×100%

1.5.2 異位子宮內(nèi)膜微血管密度

采用免疫組織化學(xué)染色法觀察。取異位子宮內(nèi)膜組織切片,常規(guī)脫蠟,PBS清洗,加入體積分數(shù)30 mL/L過氧化氫溶液處理10 min,滴加抗原修復(fù)液微波修復(fù)抗原,待冷卻至40 ℃,加入體積分數(shù)50 mL/L 胎牛血清封閉30 min,加入兔抗大鼠CD31一抗(1︰500),4 ℃孵育過夜,PBS清洗,加入二抗(1︰2 000),37 ℃孵育15 min,PBS清洗,加入DAB顯色液,蒸餾水沖洗,蘇木精復(fù)染,酒精脫水,二甲苯透明,滴入中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。以單個內(nèi)皮細胞或細胞群為一個血管,高倍鏡下選擇5個不相鄰的血管密集區(qū)視野,記錄棕黃色CD31陽性細胞數(shù),以陽性細胞占比(棕黃色細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)代表微血管密度。

1.5.3 腹腔灌洗液VEGF水平

采用ELISA法檢測。取灌洗液上清液,用酶標儀檢測450 nm位置處吸光度(A)值。操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.4 異位子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)形態(tài)

取各組異位子宮內(nèi)膜組織,切片,常規(guī)脫蠟,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)形態(tài)。

1.5.5 異位子宮內(nèi)膜組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達

采用蛋白印跡法檢測。取液氮保存的子宮內(nèi)膜組織,用眼科剪剪碎后研磨,加入PBS勻漿,注入RIPA裂解液,置于離心管內(nèi),以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速9 000 r/min冰上離心12 min,采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白質(zhì)水平。取50 μg待測蛋白,與3倍比例上樣緩沖液混合,100 ℃水浴變性,行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,常溫下加入50 g/L脫脂牛奶封閉1 h,TBST洗膜,加入兔抗大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2一抗(1︰500),4 ℃搖床孵育過夜,TBST洗膜,加入二抗(1︰2 000),常溫孵育2 h,ECL顯色,暗室曝光,經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描并分析,計算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組子宮內(nèi)膜生長抑制率對比

與模型組對比,昆布多糖組子宮內(nèi)膜生長抑制率升高,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與昆布多糖組對比,激動劑組子宮內(nèi)膜生長抑制率降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組子宮內(nèi)膜生長抑制率對比

2.2 各組子宮內(nèi)膜組織微血管密度對比

與假手術(shù)組對比,模型組CD31陽性細胞占比升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對比,昆布多糖組陽性細胞占比降低(P<0.05)。與昆布多糖組對比,激動劑組陽性細胞占比升高(P<0.05)。見表2、圖1。

注:箭頭所示為CD31陽性細胞。

表2 各組子宮內(nèi)膜組織微血管密度對比

2.3 各組腹腔灌洗液VEGF水平對比

與假手術(shù)組對比,模型組腹腔灌洗液VEGF水平升高(P<0.05)。與模型組對比,昆布多糖組腹腔灌洗液VEGF水平降低(P<0.05)。與昆布多糖組對比,激動劑組腹腔灌洗液VEGF水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組腹腔灌洗液VEGF水平對比

2.4 各組子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)形態(tài)對比

假手術(shù)組子宮內(nèi)膜腺上皮細胞結(jié)構(gòu)完整、排列整齊,腺腔完整,腺體較多。模型組子宮內(nèi)膜腺上皮細胞細胞核體積增大、排列不規(guī)則,腺體細胞數(shù)量增加,大多上皮細胞出現(xiàn)核下空泡,部分可觀察到內(nèi)膜囊腔。與模型組對比,昆布多糖組、激動劑組子宮內(nèi)膜腺上皮細胞排列較為整齊,腺體細胞數(shù)量減少,腺腔縮小。其中昆布多糖組子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)形態(tài)改善情況優(yōu)于激動劑組。見圖2。

圖2 各組子宮內(nèi)膜組織病理變化(HE染色,×200)

2.5 子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2對比

與假手術(shù)組對比,模型組子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)。與模型組對比,昆布多糖組子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2降低(P<0.05)。與昆布多糖組對比,激動劑組子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)。見表4、圖3。

圖3 子宮內(nèi)膜組織p38 MAPK、p-p38 MAPK/、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2對比

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥是子宮內(nèi)膜組織轉(zhuǎn)移至非正常位置形成的慢性炎癥疾病,表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)侵襲至宮腔之外的部位及其他器官,形成異位結(jié)節(jié)并浸潤生長[7]。目前子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制尚不完全清楚,通常認為經(jīng)血逆流導(dǎo)致內(nèi)膜間質(zhì)細胞種植于非正常位置而發(fā)展為異位病灶;并在雌激素的作用下,血管內(nèi)皮組織增殖能力提升,血管通透性增強,引發(fā)血管異常增生,促進異位病灶組織生長[8]。鑒于雌激素對維持女性生理健康具有重要作用,尋找高效、低副作用抑制血管新生且不影響雌激素分泌的藥物對于抑制異位病灶發(fā)展、恢復(fù)患者生育能力意義重大。子宮內(nèi)膜異位癥屬于中醫(yī)學(xué)“痛經(jīng)”“癥瘕”“不孕”等范疇,病機主要為瘀血阻滯沖任胞宮,氣阻為癥,血結(jié)為瘕,氣血失和,腎虛血瘀,沖任不調(diào),胞宮受阻,進而發(fā)病。治療宜以活血化瘀、補腎利水為主[9]。

CD31是一種血小板-內(nèi)皮細胞黏附因子,參與血管壁構(gòu)成,可證明血管內(nèi)皮組織存在,反映微血管密度,因此常被作為標記物評估微血管生成[10]。VEGF是直接作用于血管內(nèi)皮細胞的關(guān)鍵刺激因子,其腹腔液含量與異位子宮內(nèi)膜組織血管新生能力呈正相關(guān)[11]。中藥昆布性寒,味咸,歸肝、胃、腎經(jīng),可消痰,利水[12]。LA是從昆布中分離出的天然活性物質(zhì),主要包括褐藻膠、褐藻淀粉及褐藻糖,可抗凝血,抗輻射,抗氧化,降低尿酸[13]。本研究結(jié)果顯示,與模型組對比,昆布多糖組子宮內(nèi)膜生長抑制率升高,CD31陽性細胞占比、腹腔灌洗液VEGF水平降低,提示LA可抑制異位子宮內(nèi)膜生長及內(nèi)膜組織血管新生。

MAPK/ERK通路是將胞外刺激信號傳遞至細胞及其核內(nèi)的重要信號通路,廣泛存在于哺乳動物細胞內(nèi),在細胞增殖、分化、遷移、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[14]。p38 MAPK、ERK是該通路重要調(diào)控蛋白,均屬于絲裂原活化蛋白激酶家族。p38 MAPK被上游激酶激活后,其殘基發(fā)生磷酸化,由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核,促使相關(guān)炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄,依次激活下游環(huán)節(jié),活化ERK1/2使之磷酸化,逐級磷酸活化下游酶蛋白,產(chǎn)生瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)信號,增強炎癥反應(yīng)、促進血管內(nèi)皮細胞增殖遷移[15]。研究[16]認為,激活ERK信號通路可促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移及血管新生,增加其微血管密度,進而促進腫瘤發(fā)展,提示ERK信號通路在血管新生中具有一定作用。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組對比,模型組子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高,經(jīng)LA干預(yù)后均降低,且在LA基礎(chǔ)上增用ERK通路激動劑EGF可減弱LA對子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用,提示:MAPK/ERK信號通路在子宮內(nèi)膜異位癥中被異常激活,LZ可能通過抑制該通路對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥產(chǎn)生治療作用。

綜上所述,LA可抑制異位子宮內(nèi)膜生長及內(nèi)膜組織血管新生,從而治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥,抑制MAPK/ERK通路可能是其機制之一。