當歸半夏湯及其拆方對人卵巢癌細胞HO-8910分泌雌二醇的作用*

徐 娜,宋雪杰,司季青,王芝敏,張曉靜,梁 雪,司富春,趙 化

(1.河南省生殖健康科學技術研究院,河南 鄭州450002; 2.河南中醫藥大學中醫藥科學院河南省中醫方證信號傳導重點實驗室,河南 鄭州 450046; 3.河南省中醫院,河南 鄭州 450002)

雌激素主要由卵巢顆粒細胞合成和分泌,雌二醇(estradiol,E2)是雌激素中生物活力最強的類固醇激素,具有抗雄激素、促進子宮內膜增生、增強子宮平滑肌收縮等作用[1-3]。當前生活習慣、環境等因素影響下,E2低水平導致的多囊卵巢綜合征、不孕、卵巢早衰等成為育齡女性的常見疾病,其中多囊卵巢綜合征的發病率較高。據報道,世界女性多囊卵巢綜合征發病率為4%～12%,占育齡期女性的5%～10%,由其導致的不孕占無排卵性不孕的50%～70%。此外,卵巢早衰發病率為1%～3%[4-6]。對于E2低水平所致的多囊卵巢綜合征等疾病,目前西醫學多采用激素藥物對癥治療,顯效較慢,易復發,有高排卵率、高流產率、低妊娠率等不良反應。深入研究可促進E2分泌的治療方法和有效藥物是治療該類疾病的關鍵。前期筆者從調節卵巢顆粒細胞性激素分泌的295種中藥中篩選出當歸、山茱萸、白芍、女貞子、龜板、清半夏、浙貝母、川芎、牡丹皮、赤芍、丹參、柴胡12味有效中藥組成當歸半夏湯。本研究在此基礎上進一步優化篩選,研制能調節E2分泌的高效方劑,并研究其對E2分泌的調節作用,以期為此類疾病的臨床治療、研究和藥物開發提供有效實驗基礎。卵巢顆粒細胞是卵巢的主要功能細胞,其增殖與分化直接影響卵泡的生長啟動、發育、排卵、黃體形成及甾體激素分泌等活動。本實驗選取可分泌E2的人卵巢癌細胞HO-8910作為研究對象。

1 材料與方法

1.1 細 胞

人卵巢癌細胞HO-8910,購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

1.2 藥品、試劑及儀器

當歸半夏湯藥物組成:當歸、山茱萸、白芍、女貞子、龜板、清半夏、浙貝母、川芎、牡丹皮、赤芍、丹參、柴胡。藥材均購自河南中醫藥大學第三附屬醫院。取上述12味中藥各50 g,分別避光浸泡于250 mL 體積分數 950 mL /L乙醇中;振蕩,2次/d;7 d天后將每味中藥的乙醇提取物過濾,旋蒸,濃縮,干燥;待藥物充分干燥后,稱取適量中藥,先配制成300 g/L的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)藥液,再用培養基稀釋成4 g/L的藥物儲備液;0.22 μm濾頭過濾除菌,-20 ℃冰箱保存備用;實驗時配制成所需質量分數的藥液。950 mL /L 分析純乙醇,天津市恒興化學試劑制造有限公司產品,批號20201210;RPMI 1640培養基,賽默飛世爾科技公司GIBCO品牌產品,批號2333386;胎牛血清,上海雙洳生物科技有限公司LONSERA胎牛血清,批號OH12343;胰蛋白酶、青鏈霉素混合液(100×)、噻唑藍溴化四唑(MTT)、DMSO,均為北京索萊寶科技有限公司產品,批號依次為12271041、20200626、917Q057、1121E0333。RE-6000A型旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠產品;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實驗設備有限公司產品;DZF-6050型真空干燥箱,德國賓德公司產品;HERA cell 150Heraeus細胞培養箱,美國科峻公司(Kendro)產品;Axiovert25倒置熒光顯微鏡,蔡司光學儀器(上海)國際貿易有限公司產品;EPOCH型酶標儀,美國伯騰儀器有限公司產品。

1.3 細胞培養

將細胞置于體積分數 50 mL /L CO2、37 ℃、飽和濕度培養箱中培養,當細胞匯合率為70%～80%時,給予含乙二胺四乙酸胰蛋白酶消化傳代處理,2～3 d傳代1次。細胞消化處理后,使用細胞計數儀計算細胞濃度,取1×106個細胞接種于直徑10 cm培養皿中,顯微鏡下觀察細胞生長狀態。

1.4 當歸半夏湯中單味中藥的篩選

設空白對照組和加藥組,每組3個復孔。取生長旺盛的HO-8910細胞,用胰蛋白酶消化處理為單細胞懸液,用不含血清的1640培養基以1×104個細胞/孔接種于1.5 mL EP管中,100 μL/孔,置于37 ℃、體積分數50 mL /L CO2、飽和濕度培養箱中培養。適應性培養30 min后,空白對照組每孔加100 μL 1640培養基;加藥組將當歸半夏湯中12味待選中藥儲備液配成質量分數200 mg/L的工作液,每孔加入100 μL,使藥物最終質量分數為100 mg/L;繼續培養24 h;將EP管以離心半徑5 cm、轉速1 000 r/min離心10 min,收集細胞上清。采用放射免疫測定(radioimmunoassay,RIA)法測定各組上清液中E2含量,篩選出對HO-8910細胞增殖無顯著影響但可促進E2分泌的藥物。中藥促進細胞E2分泌百分比(%)=(加藥組單位細胞分泌E2水平-空白對照組單位細胞分泌E2水平)/空白組單位細胞分泌E2水平×100%

1.5 單味藥量效關系檢測

取生長旺盛的HO-8910細胞,用胰蛋白酶消化處理為單細胞懸液,用不含血清的1640培養基以1×104個細胞/孔接種于96孔培養板,100 μL/孔,置于37℃、50 mL /L CO2、飽和濕度培養箱中培養。設空白對照組和加藥組,每組3個復孔。根據1.4項下藥材篩選結果,把各入選藥物分別配制成質量分數為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 mg/L 8個梯度藥液,進行藥物劑量-藥理效應實驗。加藥方法同1.4,空白對照組每孔加100 μL 1640培養基,中藥組加入不同質量分數藥液,繼續培養24 h;收集細胞上清,采用RIA法測E2水平;收集上清,每孔加入100 μL MTT,培養箱中繼續培養4 h后去掉上清;每孔加入150 μL DMSO溶液,酶標儀測定OD值。計算空白對照組和加藥各組單位細胞分泌E2水平(即E2水平/相應OD值)。采用GraphPad Prism 8.0.1軟件,以藥物質量分數為橫坐標、藥物促進HO-8910細胞E2分泌百分比為縱坐標繪制劑量-效應關系曲線,求出單味藥促進E2分泌的半數效應濃度(median effect concentration,EC50)。

1.6 當歸半夏湯全方及拆方對HO-8910細胞E2分泌的量效關系

將1.4項下篩選出的8味中藥按照功效分為補腎養血(酒萸肉、當歸、白芍)、化痰(浙貝母、清半夏)和活血(丹參、牡丹皮、赤芍)3類,分別組成補腎養血方、化痰方和活血方。設3個拆方組和1個全方組,分別以各組方中單味藥EC50值的0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4倍的量進行混合,同時設空白對照組,每組3個復孔。加藥和結果測定方法同1.5,計算空白對照組和加藥各組HO-8910細胞分泌的E2水平。采用GraphPad Prism 8.0.1軟件,以藥物質量分數為橫坐標、藥物促進HO-8910細胞E2分泌百分比為縱坐標繪制劑量-效應關系曲線,求出當歸半夏湯全方和補腎養血、化痰、活血拆方的EC50。

1.7 當歸半夏湯全方及拆方對HO-8910細胞E2分泌作用的時效關系

全方組及拆方組分別以各組方中單味藥EC50值進行混合,同時設空白對照組,每組3個復孔。細胞處理和加藥同1.5,采用MTT比色法檢測12、24、36、48、60、72 h 6個時間點全方及3個拆方促進HO-8910細胞E2分泌百分比,繪制時效關系曲線,確定時間-藥效關系。

1.8 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件對數據進行統計分析,計算EC50[7]。

2 結 果

2.1 當歸半夏湯中單味中藥的篩選結果

以質量分數100 mg/L的各單味中藥作用24 h,得到對HO-8910細胞增殖無顯著影響但對E2分泌有明顯促進作用的8味中藥,分別是酒萸肉、當歸、白芍、浙貝母、清半夏、丹參、赤芍和牡丹皮。見表1。此8味中藥作用HO-8910細胞24 h,對細胞形態無顯著影響,細胞呈不規則橢圓形或梭形,核漿比較豐富。

表1 當歸半夏湯中12味中藥對HO-8910細胞分泌E2的影響

2.2 8種中藥與HO-8910細胞E2分泌的量效關系

8味中藥對HO-8910細胞E2分泌的促進作用隨著藥物質量分數的增加而增強,見表2。經GraphPad Prism 8.0.1統計軟件計算,各單味藥的EC50分別是:酒萸肉 198.7 mg/L,當歸 162.8 mg/L,白芍342.1 mg/L,浙貝母116.5 mg/L,清半夏 486.8 mg/L,丹參 82.83 mg/L,牡丹皮 143.9 mg/L,赤芍 218.8 mg/L。

表2 不同質量分數的8種藥物促進HO-8910細胞E2分泌百分比

2.3 當歸半夏湯全方及拆方與HO-8910細胞E2分泌的量效關系

補腎養血方、化痰方、活血方及當歸半夏湯全方均可促進HO-8910細胞E2分泌,對E2分泌的促進作用隨藥物質量分數的增加而增強,見表3和圖1。作用大小依次為:全方>活血方>補腎養血方>化痰方。補腎養血方組、化痰方、活血方及全方所含各單位中藥的EC50依次是上述2.2項下量效關系得出的單位中藥EC50的0.47、0.90、0.30、0.19倍。

圖1 當歸半夏湯全方及拆方促進HO-8910細胞

表3 不同劑量當歸半夏湯全方及拆方促進HO-8910細胞E2分泌百分比

2.4 當歸半夏湯全方及拆方與HO-8910細胞E2分泌的時效關系

補腎養血方、化痰方、活血方及全方均可促進HO-8910細胞E2分泌,對E2分泌的促進作用在12～48 h之間隨時間的增加而增強,見表4和圖2。

圖2 當歸半夏湯全方及拆方促進HO-8910細胞E2分泌時效關系對比

表4 不同作用時間當歸半夏湯全方及拆方促進HO-8910細胞E2分泌百分比

3 討 論

E2是雌激素中最主要、活性最強的激素。基于E2在生殖系統中的重要作用,本研究運用可分泌E2的人卵巢癌細胞HO-8910建立調節E2分泌的藥物篩選方法,在前期初步篩選所得12味有效中藥基礎上進一步篩選,得到可促進HO-8910細胞E2分泌的酒萸肉、當歸、白芍、浙貝母、清半夏、丹參、赤芍、丹皮8味中藥,并探究其與E2水平的量效和時效關系,為E2低水平導致的不孕、卵巢早衰、多囊卵巢綜合征、月經不調等疾病臨床治療和藥物研發提供新的依據。由8種中藥組成的當歸半夏湯及補腎、化痰、活血拆方與多囊卵巢綜合征、卵巢早衰、不孕的中醫病機相合。中醫學認為,腎主生殖,為先天之本。腎中精氣充盈,滋養五臟六腑,維持正常的生長發育。對于女性而言,腎精充足,腎陰腎陽得以相互轉化,滋養天癸,沖任調暢,經水應期而至,正常行經受孕。若腎中精氣虧虛,腎陰腎陽失衡,轉化不利,則會引起人體生長和生殖機能障礙。腎陰是卵泡生長發育的物質基礎,能滋養孕卵促其生長成熟;腎陽是卵子排出的內在動力,能鼓動卵子順利排出;因此,腎虛是生殖內分泌功能異常、雌激素分泌異常的主要原因[8-10]。同時,腎為水臟,與體內水液調控密切相關。若腎氣不足,腎陽虛損影響氣化功能,蒸騰氣化失司而影響津液代謝,濕邪停滯,阻遏氣機,則聚集成痰;此外,氣虛血瘀,瘀血凝滯胞宮或濕濁流注沖任胞宮,使沖任失調,引起月經失調;或腎虛不能攝精成孕,而致不孕。因此,治療E2分泌水平低導致的不孕、卵巢早衰、多囊卵巢綜合征、月經不調等疾病,應順應腎中陰陽消長的生理變化,進行補腎、活血、化痰[11-13]。酒萸肉補益肝腎,固沖任;當歸補血調經;白芍斂陰養血;酒萸肉、當歸、白芍補肝腎,養血;浙貝母清熱化痰;生半夏燥濕化痰;丹參活血調經;牡丹皮、赤芍活血祛瘀。8味藥共奏補腎養血、化痰活血之效。雌激素分泌減少是育齡婦女發生生殖內分泌功能異常疾病的主要原因,本研究得出的當歸半夏湯可為雌激素減少而引起的生殖內分泌功能異常所致的不孕、月經紊亂等的臨床治療、研究和藥物開發提供了研究基礎。