人工神經網絡和響應面法優化黑曲霉發酵產淀粉酶

摘要：發酵過程的培養基組成及培養條件是影響黑曲霉產淀粉酶產量的關鍵。為提高黑曲霉F223 的產酶水平，首先通過單因素實驗及Plackett-Burman（PB）實驗篩選出了顯著影響淀粉酶酶活的成分：豆粕、玉米漿及可溶性淀粉。通過最陡爬坡實驗以及中心組合實驗獲取回歸建模數據集，以淀粉酶酶活為響應變量，分別利用傳統的多項式回歸以及人工神經網絡回歸擬合方法，建立了培養基組成與酶活之間的回歸模型，得到了黑曲霉F223 生產淀粉酶的培養基和培養條件的最優解。結果表明，人工神經網絡結合遺傳算法在數據擬合和預測能力方面優于多項式回歸方法，用該算法為基礎優化得到的培養基進行搖瓶發酵實驗，最終淀粉酶產量達到5 566.79 U/mL，相比于未優化培養方案提升了92.6%。

關鍵詞：黑曲霉；淀粉酶；響應面方法；機器學習；人工神經網絡

中圖分類號：Q815 文獻標志碼：A

α-淀粉酶是一種重要的酶制劑，現已在食品加工、飼料、造紙及紡織等工業領域被廣泛應用，具有巨大的商業價值和市場需求[1]。據統計，α-淀粉酶作為工業用酶，其產值于2020 年已達到7.5×109 USD，應用前景良好[2]。目前α-淀粉酶主要的生產商有羅氏（瑞士）、諾維信（丹麥）、杜邦（美國）等公司。

工業用α-淀粉酶根據其來源可以分為兩類：細菌α-淀粉酶和真菌α-淀粉酶，二者具有不同的酶學特點[3]，其中真菌來源的淀粉酶具有直接水解生淀粉的能力，并且在糖化工藝的應用中，真菌來源的α-淀粉酶可以代替β-淀粉酶作為糖化劑，用于生產高麥芽糖漿，成為高麥芽糖漿生產過程中的關鍵酶制劑。黑曲霉是優良的酶蛋白表達宿主[4]，其酶蛋白產物分泌到胞外，易于提取、發酵培養基成本低、對于pH 和溫度的穩定性好等優點。目前真菌α-淀粉酶的生產主要采用霉菌固態發酵的方式，存在發酵效率低、過程調控難等問題，如Premalatha 等[5] 以溜曲霉作為生產宿主，通過固態發酵進行α-淀粉酶生產，產量最高達到519.40 u/g；Mahmood 等[6] 通過黑曲霉固態發酵生產α-淀粉酶，通過培養條件及培養基優化，產量達到1 298.12 u/g。少數液態發酵多采用未經改造的原始霉菌菌株，發酵最終酶活較低，低于2 000 U/mL[7-8]。本研究所用菌株為經代謝工程改造的黑曲霉F223 菌株，該菌株通過CRISPR/Cas技術在基因組上定點敲除了糖化酶基因，并整合來源于米曲霉的α-淀粉酶基因表達盒AmyA，可高效表達米曲霉α-淀粉酶。

微生物發酵過程中可變因素與產量之間的關系是復雜非線性的，若僅通過單因素或正交實驗進行篩選，則需要花費較大的時間成本，此時生物過程的建模與優化對于高效經濟地開發生物發酵工藝非常重要[9-10]。相比于傳統的建模方法，通過機器學習方法進行回歸建模提供了一種獨立于傳統模型的靈活處理方法[11]。機器學習算法可分為有監督算法和無監督算法兩類[12]，其中有監督算法主要用于挖掘特征值與目標值之間的相關性，以實現基于特征值輸入來預測對應的目標值。有監督學習算法在發酵工業中得到廣泛應用，包括培養基優化、發酵建模過程、控制優化以及發酵分批補料等，已經成為當前研究的熱點之一[13-14]。人工神經網絡（Artificial NeuralNetwork，ANN）是一種常用的有監督學習算法，其將輸入數據集所得到的響應與目標值進行比較，修改內部權值來校正偏離的響應，并通過迭代訓練過程模擬變量之間的非線性變化，以此分析復雜系統中存在的非線性關系。

因此，本研究基于ANN 算法搭建了新的黑曲霉產淀粉酶培養方案優化流程，由初始培養基出發，通過單因素實驗考察不同組分及條件對于產酶的影響，由Plackett-Burman（PB）實驗和最陡爬坡實驗初步確定對于淀粉酶生產影響顯著的因素及對應濃度范圍，最后基于中心組合實驗所得數據集，利用多項式回歸建模結合最小二乘回歸算法尋優和ANN 回歸建模結合遺傳算法尋優，解析培養基成分、培養條件與產量之間的非線性關系，優化影響淀粉酶產量關鍵因素的水平，以期確定最優的黑曲霉培養方案，為后續黑曲霉產淀粉酶發酵優化提供數據支持。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

1.1.1 實驗菌株

黑曲霉（Aspergillus niger） F223 由中國農科院提供。

1.1.2 實驗試劑

葡萄糖、木糖、麥芽糖、果糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；麥芽糊精、玉米糊精：分析純，上海源葉生物科技有限公司；酵母粉：分析純，安琪酵母股份有限公司；培養基用金屬離子鹽、無機鹽：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；可溶性淀粉：分析純，凌峰化學試劑有限公司；玉米漿：分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司；豆粕：分析純，北京索萊寶科技有限公司； 3、5-二硝基水楊酸（DNS） 試劑： Codow氪道-廣州和為醫藥科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）：碧云天生物技術公司。

1.1.3 培養基

（1） PDA（Potato Dextrose Agar）培養基（g/L） ：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15；

（2）種子培養基及初始發酵培養基（g/L）：豆粕30，玉米漿20，蔗糖50，硫酸鎂1。

1.2 測試與表征

pH 計（梅特勒-托利多公司），ZHWY-3212 型旋轉式搖床（上海智城公司），酶標儀（美國Thermo 公司），AL204 型分析天平（梅特勒-托利多公司），PYXDHS-40*50 型培養箱（中國躍進醫療器械公司） ，BHS-4 型水浴鍋（中國群安實驗儀器公司），STY-1-ADK 型滲透壓儀（中國天大天發科技有限公司公司），GZX-9420MBE 型鼓風烘箱（華連醫療器械公司）

1.3 黑曲霉的活化與培養

將?20 ℃ 冰箱保藏的A.Niger F223 甘油管解凍，無菌接種環蘸取后劃線于PDA 平板，于30 ℃ 恒溫培養箱培養48 h 得到單菌落，挑取單菌落并接種至液體種子培養基活化培養60 h，待鏡檢可見完整菌絲，并且離心菌絲體體積（PMV）達到40% 以上，即可接種至發酵培養基。

1.4 單因素實驗

微生物培養基主要成分有以下幾類：碳源、氮源、無機鹽、金屬離子等；影響菌株生長及生產的培養條件主要有：滲透壓、pH、接種量、接種種齡等。本研究通過單因素實驗，在初始培養基的基礎上，依次改變一種培養基組分，初步篩選發酵培養基的組成及培養條件[15]。

遲效氮源：豆粕（Soybean meal，SM）、大豆蛋白胨（Soy Peptone，SP）、胰蛋白胨（Tryptone，TRY），添加量均為30 g/L； 速效氮源： 玉米漿（Corn SteepLiquor， CSL） 、牛肉膏（Beef Extract， BE） 、酵母粉（Yeast Extract，YE），添加量均為20 g/L；10 種供試碳源（葡萄糖、木糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、麥芽糊精、玉米糊精）添加量均為50 g/L；5 種供試緩沖鹽（磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈣），添加量均為1 g/L；6 種供試金屬離子（鈣、鐵、鎂、鋅、鈷、鎳離子），添加量均為20 mmol/L。

1.5 PB 實驗

研究使用Design expert 10.0.1 設計PB 實驗，篩選由OFAT 實驗中所獲得的8 種培養基成分及培養條件，其中A、B、C、D、E、F、G、H 分別代表磷酸二氫鉀、豆粕、玉米漿、可溶性淀粉、滲透壓、接種量、氯化鈣、初始pH 8 個變量因素，所有因素都在高（+1）、低（?1）兩水平上進行12 次實驗，實驗設計如表1 所示。

1.6 最陡爬坡實驗（Steepest Ascent Experiment，SAE）

在PB 實驗所構建的一階模型中，得到顯著影響因子的系數，以此計算最陡爬坡實驗的步長[16]，在最陡爬坡實驗（表2）中所得到最高淀粉酶酶活所對應的顯著變量水平，即作為后續響應面優化的中心點。

1.7 中心組合實驗（Central Composite Design， CCD）

研究中使用Design expert 10.0.1 設計CCD 實驗，如表3 所示，其中包括6 組失擬項測試的中心點和14 個非中心點，共20 次實驗。20 組完全隨機實驗進行3 次生物學重復。

1.8 回歸擬合建模

（1）多項式回歸建模

將CCD 實驗所設計的參數以及在實驗中得到的不同參數組合所對應的響應值，使用Design expert10.0.1 軟件進行二項式回歸擬合[17]。

（2）人工神經網絡建模

本研究中使用MATLAB 2020a 中的DeepLearningToolbox 14.6 進行神經網絡擬合，將CCD 實驗所得結果作為數據集進行神經網絡訓練，訓練過程中數據按70%、15%、15% 的比例分為訓練集、驗證集及測試集，其中輸入變量為顯著因素豆粕、玉米漿和可溶性淀粉的質量濃度，響應變量為淀粉酶酶活。

1.9 生化參數檢測方法

1.9.1 PMV測定

由于培養基中含有不溶性成分，本實驗采用PMV 作為菌體生長的監測指標[18]，發酵過程中定點取樣1 mL，12 000 r/min 離心5 min，將菌絲體與發酵上清分離，將沉淀菌絲體的體積除以取樣發酵液總體積來計算PMV。

1.9.2 酶活檢測

本實驗采用二硝基水楊酸（DNS）法進行淀粉酶酶活檢測[1]，每分鐘生成1 μmol還原糖需要的酶量為一個酶活力單位（1U），單位體積酶活即為1 U/mL。于發酵終點取樣1 mL 進行酶活力測定，離心后取上清，稀釋一定倍數后與1 mL的10 g/L可溶性淀粉溶液混勻，于50 ℃ 恒溫水浴鍋反應10 min，反應結束后加入2 mL DNS 試劑，沸水浴5 min 進行顯色，顯色結束后冷卻至室溫，用超純水將反應體系定容至25 mL，使用酶標儀在540 nm波長下讀取吸光值，并根據標準曲線計算酶活。

1.9.3 蛋白濃度測定

研究中使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒對發酵體系中的蛋白濃度進行測定。

1.9.4 滲透壓測定

研究中使用冰點滲透測定壓儀對發酵體系的滲透壓進行測定。

1.10 數據處理

本研究每個樣品分析設置3 次生物學重復，采用Graphpad Prism 8.2.4 進行數據處理及圖表繪制；使用Design Expert 10.0.1 進行PB 實驗和CCD 實驗設計和二項式回歸建模分析；使用MATLAB 2021a進行人工神經網絡回歸建模及遺傳算法求解。

2 結果與討論

2.1 培養基的初篩

2.1.1 不同培養條件及菌株活化方法對產酶的影響

由圖1 所示各組單因素實驗結果可得，當滲透壓為2 060 kPa、初始pH 為7 時分別達到各組實驗的最高產酶量。由圖1（a）可得，較高的滲透壓通過增加黑曲霉胞內外的滲透壓差，從而促進淀粉酶的胞外分泌，產量提高，但過高的滲透壓又會影響菌株生長，故最適初始滲透壓應設為2 060 kPa。pH 是發酵過程調控的關鍵參數之一[19]，由圖1（b）和（c）可得，黑曲霉F223 產淀粉酶過程較合適的pH 值為6.5～7.0、接種量為2% 時，可以較好地維持菌株生長代謝，同時對于中性α-淀粉酶可以更好地發揮酶的催化活性。

2.1.2 不同碳氮源對產酶的影響

研究選擇了多種碳、氮源進行單因素實驗分析，不同成分所對應的發酵終點酶活如圖2 所示。

由圖2（a）可得，相比于對照碳源蔗糖，葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、果糖、麥芽糊精、半乳糖、甘露糖和玉米糊精作為碳源時，發酵終點產量皆有不同程度的提高。其中葡萄糖、麥芽糖及果糖作為還原糖，通過提高菌體生長代謝活力來促進產物合成；可溶性淀粉、玉米糊精及麥芽糊精則對于淀粉酶蛋白表達有誘導作用[20]，通過提高淀粉酶的誘導表達效率提高產量。考慮到發酵成本及實際生產過程中經濟效益，最終選擇了成本較低且誘導表達效果較好的可溶性淀粉作為碳源，其作為碳源進行發酵時酶活最高可達4 567 U/mL。

由圖2（b）、圖2（c）可得，豆粕和玉米漿分別作為最理想的遲效和速效氮源，且當豆粕與玉米漿質量比為3∶2 時，酶活可達3 524 U/mL（圖2（c））。結果表明，優化后的氮源濃度配比對黑曲霉在發酵過程中的前期菌體生長和后期的產物合成有直接影響[21]。

2.1.3 不同緩沖鹽及金屬離子對產酶的影響

本研究考察在初始培養基的基礎上添加緩沖鹽和金屬離子對發酵終點酶活產量的影響，結果見圖3。由圖可得，添加磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀作為緩沖鹽時酶活提高了約15%，表明磷酸鹽的添加除了pH 調節以外，還可能促進參與輔酶、核酸等多種微生物生長代謝關鍵元素的合成，以及改善培養環境的pH，優化了菌株生長[22]。此外，鈣離子的補充使得終點酶活提高了13%。已有文獻[23-24] 表明培養體系中的鈣離子可以改善細胞膜通透性，使發酵終點淀粉酶酶活有所提高。綜上，本研究選擇了磷酸二氫鉀以及鈣離子作為發酵培養基中的無機鹽及金屬離子成分。

2.2 PB 實驗

結合單因素實驗的實驗結果進行PB 實驗設計，以考察發酵條件中的8 個因素對于黑曲霉產淀粉酶的影響并篩選顯著影響因子，具體實驗結果及分析如表4 所示，其中*為Plt;0.05，**為Plt;0.01。PB 實驗所得模型的P 值為0.024 9，小于0.05，表明該模型顯著，具有統計學意義。模型的線性回歸方程為Y =2 767.29 + 142.91A + 342.68B + 364.92C + 273.60D ?254.93E + 85.37F + 28.01G + 141.38H。其中豆粕、玉米漿及可溶性淀粉的P 值分別為0.010 8、0.009 5、0.016 7，均小于0.05，表明三者對于黑曲霉產淀粉酶的發酵影響顯著，重要性順序為玉米漿gt;豆粕gt;可溶性淀粉。其中滲透壓雖然P 值同樣小于0.05，但在模型中表現為負效應，結果表明，高滲環境不適用于黑曲霉進行淀粉酶蛋白的生產代謝，故選擇豆粕、玉米漿及可溶性淀粉3 個因素進行后續最陡爬坡及優化實驗。

2.3 最陡爬坡實驗

最陡爬坡實驗結果如表5 所示，隨著3 個因素水平的逐漸增加，淀粉酶酶活呈現先升高后下降的趨勢，其中實驗編號4 的淀粉酶酶活達到最高，因此以豆粕48.17 g/L、玉米漿40 g/L 以及可溶性淀粉52.5 g/L 作為后續CCD 實驗設計的中心點。

2.4 多項式回歸擬合

以最陡爬坡實驗所確定的水平中心點，進行中心組合實驗并擬合響應曲面，擬合結果如表6所示。經Design Expert 10 軟件對CCD 實驗結果進行二次多項回歸擬合得回歸方程為Y = 5 055.44+415.92A+292.44B+407.92C?210.04AB+42.01AC?306.28BC?637.56A2?621.89B2?671.58C2。由表6 的分析（ANOVA）結果所示，模型回歸系數R2 = 0.912 1，表示回歸模型的預測性能良好，P 值為0.000 3（P lt; 0.01），表明該模型顯著且擬合效果好。失擬項的P 值為0.067 4（P gt;0.05），表明所得回歸模型與實驗結果擬合時，非正常誤差占比小，由此表明所得模型可以較好地預測黑曲霉產淀粉酶的最優培養方案。模型中A2、B2 及C2 所對應的P 值均小于0.01，表明所對應的因素對于響應值的單獨影響極顯著，但各因素的交互作用對于響應值影響不顯著。

二維等高線圖及三維響應曲面圖（圖4）可以進一步分析各因素之間的相互作用，以及因素水平變化對于淀粉酶酶活的影響。

由擬合的響應曲面可得，隨著各培養基成分濃度的降低，培養過程中可利用的營養成分減少，影響黑曲霉菌株的生長及生產，淀粉酶酶活均呈現下降趨勢。淀粉酶酶活隨著培養基成分濃度的增加而提高，但進一步增加則會影響淀粉酶產量。其中，不溶性成分豆粕，其濃度過高會影響液體發酵過程的溶氧含量，導致黑曲霉生長受限，影響產酶。可溶性淀粉濃度過高將導致前期碳源利用過度，耗糖產酸導致pH 快速降低。玉米漿作為復合氮源，其主要成分中含有較多有機酸[25]，分解代謝釋放乳酸會導致發酵環境偏酸性，影響菌體生長和產物合成。

通過二次多項擬合得到回歸方程后，以淀粉酶酶活作為響應值，利用最小二乘回歸求解使響應值最大的最優解，結果表明：當豆粕38 g/L、玉米漿31 g/L、可溶性淀粉49 g/L 時，模型預測該條件下淀粉酶酶活達到5 196.45 U/mL。

經實驗驗證，以上述配比的培養基進行黑曲霉菌株的發酵生產，搖瓶發酵7 d 后淀粉酶酶活達到5 084.68 U/mL，略低于預測值，但對比初始培養基的發酵產量（2 889.38 U/mL）提高了75%。

2.5 人工神經網絡回歸擬合

采用二項式回歸擬合雖可以快速建立響應面模型，所得模型具有易理解、所需樣本量少等優點，但受限于模型訓練算法和尋優算法，二項式回歸模型無法在全局范圍內尋優，為了更好地擬合培養基成分與產量之間的復雜非線性關系，本研究還采用了人工神經網絡方法進行回歸擬合。神經網絡擬合的過程中通過數據特征提取，與神經網絡的權重相互作用，神經元對輸入變量組合進行非線性變化后，使得神經網絡模型具備針對多變量復雜關系的非線性表征能力，可以更好地擬合非線性關系并在全局范圍內尋優[26-27]。

研究將CCD 實驗所得到的數據集用于ANN 模型的訓練，使用 MATLAB?神經網絡工具箱改變輸入層中神經元的數量，結果表明當隱藏層節點數為8 時，產生了最佳的學習和泛化性能，表現為最低的均方誤差（MSE）和最高的 R2 值（圖5）。

以最優神經網絡結構進行模型訓練，綜合所有數據進行評估并得到模型的總體回歸擬合效果。模型擬合結果、模型性能驗證結果如圖6 所示。其中訓練集、驗證集、測試集以及總體數據的R2 分別達到0.992 1、0.999 8、0.989 9 及0.986 2，表明該模型可以準確描述培養基成分與淀粉酶產量之間的非線性關系。

此外，圖7 展示了神經網絡模型的訓練過程，通過多次迭代優化模型性能，使模型預測結果與實際值之間的均方誤差逐步降低。由圖可得，經3 次迭代訓練后，模型在3 組數據集上的預測誤差均降至最低，表明模型的預測性能此時已至最佳狀態。

基于構建好的神經網絡模型，研究采用遺傳算法進行尋優，通過找到最佳的培養基成分配比使產量達到最高。將人工神經網絡所擬合的回歸方程作為遺傳算法尋優的適應度函數，經遺傳算法求解后得到的最優培養基條件為（g/L） ：豆粕36、玉米漿33、可溶性淀粉56。以該成分配比進行黑曲霉菌株的培養及產物發酵，最終酶活達到5 566.79 U/mL，對比二次多項回歸模型所優化發酵培養基的終點酶活（5 084.68 U/mL）提高了9%，對比初始黑曲霉培養基的終點酶活（2 889.38 U/mL）提高了92.6%。

由回歸擬合結果來看，人工神經網絡算法擬合所得模型總體回歸系數R2 為0.986 2，對比響應面法所得回歸模型的回歸系數R2 為0.912 1，前者擬合效果更佳，基于人工神經網絡算法具有收斂速度快、計算時間短以及統計分析能力強等優勢，所得模型可以更好描述培養基成分與產量之間的復雜關系，同時利用魯棒性強、尋優性能更佳的遺傳算法在約束內搜索尋優，可以更好地找到使響應值最大的最優解[28]，在實驗驗證中也表現出更好的產酶水平。

2.6 不同擬合模型所得優化配方發酵結果對比

將二次多項回歸模型（RSM）與神經網絡模型（ANN）求最優解后所得的培養基配方，用于黑曲霉的發酵培養，并結合菌濃（PMV）、淀粉酶酶活及胞外蛋白濃度3 個參數進行對比分析，結果如圖8 所示。

由圖8 所示，利用初始培養基、二項式回歸模型優化培養基以及神經網絡模型優化培養所進行黑曲霉發酵培養，可見培養基的成分差異和濃度差異對于黑曲霉的生長及生產都有影響。初始培養基以蔗糖為碳源并且未進行微量元素和培養工藝優化，雖然菌濃可以生長至優化后水平（PMV 約為36%），但淀粉酶酶活及蛋白濃度較低。成分優化后的兩種配方更適用于淀粉酶的高效誘導表達，酶活和蛋白濃度顯著提高。

相較于二項式回歸模型，通過神經網絡模型結合遺傳算法優化配方發酵效果更佳。具體而言，前者在于減少了豆粕的濃度并且增加了玉米漿濃度，產量提高9%。這是由于豆粕作為不溶性成分，在供氧條件有限的搖瓶培養過程中[29]，其濃度過高易導致供氧不足，氧限情況在黑曲霉這種好氧菌株的發酵過程中不利于菌株生長及產酶。此外，人工神經網絡模型優化配方中，提高可溶性淀粉的濃度，有利于在搖瓶發酵中維持菌株的生產代謝活性，促進淀粉酶的生產。不同配方培養時，發酵終點的生物量不同，表明底物代謝流傾向于生產而非生長，從而使得產物得率更高。本研究所采用的人工神經網絡結合遺傳算法適用于黑曲霉產淀粉酶發酵這種高度非線性的生物系統，所建立的模型具有較高的仿真精度。

3 結 論

本研究考察了多種碳氮源、無機鹽及金屬離子對于黑曲霉產淀粉酶的影響，并通過單因素實驗確定了初始發酵培養基組分及發酵條件。由PB 實驗確定豆粕、玉米漿及可溶性淀粉為影響淀粉酶產量的顯著因素后，進一步構建多項式回歸模型以及人工神經網絡回歸模型以擬合3 個組分的濃度與淀粉酶產量之間的非線性關系，通過尋優得到產量最大的培養基配方，其中，豆粕、玉米漿及可溶性淀粉的濃度分別為（g/L）：38，31，49 或者是36，33，56。搖瓶驗證實驗結果表明，基于人工神經網絡模型所得優化配方發酵效果較好，其淀粉酶酶活可達5 566.79 U/mL，比優化前提高了92.6%；蛋白濃度可達29 g/L，比優化前提高了51.5%，具有較好的應用前景。

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（責任編輯：王曉麗）

基金項目： 國家重點研發計劃（2021YFC2100205）