皺葉山姜組織培養技術研究

鄧小果何柔靜李貴雨

(1.海南開放大學農業農村學院，海南 海口 570208；2.中國熱帶農業科學院海口實驗站，海南 海口 571101)

皺葉山姜(Alpinia rugosa S.J.Chen &Z.Y.Chen)是姜科山姜屬新種，皺葉山姜產自海南吊羅山，生長在陰暗潮濕的山谷森林；海拔600～800m。皺葉山姜假莖0.5～1.2m，葉舌皮質，雙葉，長約1cm，具長硬毛；葉柄1～5cm，短柔毛；葉片長圓，葉面無毛，背面密被短柔毛，極具皺紋，基部深心形重疊。總狀花序直立，密花，有9～20朵花，蒴果橢圓形。自1990年引種到華南植物園后，國內的西雙版納植物園和國外夏威夷自華南植物園引種。夏威夷已將皺葉山姜繁殖應用。該植物以其葉皺縮，具有極高的園藝觀賞性，是姜科新型園藝觀賞作物。

植物組織培養廣泛應用于植物脫毒和快速繁殖[1-5]、倍性育種[6-8]、種質資源保存[9]等研究。皺葉山姜可采用分株繁殖的方式進行種苗繁殖，此方法雖能保持母體的性狀，但繁殖系數較低。目前關于皺葉山姜組織培養方面的研究尚未有報道。本研究以皺葉山姜吸芽為試驗材料，探討了1/2MS、MS基本培養基、激素及其濃度對芽的誘導、增殖及生根培養的影響，篩選出最佳培養基，建立了皺葉山姜組織培養技術，不僅為其快速繁殖、工廠化生產提供技術基礎，還有利于保持母株的優良性狀。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為皺葉山姜健壯吸芽。

1.2 方法

1.2.1 外植體的采取及處理

在晴朗天氣的10：00左右，選擇健壯的母株，取約10cm大小一致的吸芽作為外植體，切下來的吸芽用自來水洗掉其上面的泥土，然后用解剖刀將其葉鞘撥除，后用自來水沖洗5min，置于超凈工作臺上，準備消毒。

1.2.2 外植體的滅菌

將處理好的吸芽置于超凈工作臺上，用沾有75%的棉花擦拭處理好的吸芽，放入75%的酒精中輕輕搖動10s，用無菌水浸洗1～2次。接著，將吸芽放入0.1%升汞溶液中消毒8min，再用無菌水浸洗3～4次。

1.2.3 誘導培養

將經過消毒好的吸芽，接種于誘導培養基中。設置1/2 MS、MS為基本培養基，在2種培養基中分別加入不同濃度的6-BA，6-BA濃度分別為0mg·L-1、1.0mg·L-1、2.0mg·L-1、3.0mg·L-1、4.0mg·L-1。30d后統計誘導發芽率。

發芽率(%)=發芽數/(接種數-污染數)×100%

1.2.4 增殖培養

將經誘導培養后形成的芽，接種于誘導培養基中，以1/2 MS為基本培養基，添加不同濃度的6-BA和TDZ組合，6-BA濃度為1.0mg·L-1、2.0mg·L-1，TDZ濃度為0mg·L-1、1.0mg·L-1、2.0mg·L-1、3.0mg·L-1、4.0mg·L-1。30d后統計增殖系數。

增殖系數=產生芽數/接種芽數

1.2.5 生根培養

叢生芽經過數次繼代增殖之后，可進行壯苗生根。當叢生苗上有4片葉子并且苗高為3cm時，將叢生苗分株后，轉接到生根培養基中，基本培養基為1/2 MS，在培養基中加入NAA濃度分別0.1mg·L-1、0.2mg·L-1、0.3mg·L-1、0.4mg·L-1。30d后統計生根率。

生根率(%)=生根株數/接種株數×100%

1.2.6 培養條件

本試驗配置的誘導、增殖及生根培養基均加入30g·L-1蔗糖和7.5g·L-1卡拉膠，pH值為5.8，在121℃、1.1kg·cm-2的高溫高壓下滅菌22min。培養室光照強度為1000～1200lx；溫度26℃左右。

2 結果與分析

2.1 1/2 MS、MS基本培養基及不同6-BA濃度對叢生芽誘導的影響

將接種在誘導培養基中吸芽放置培養室中進行7d的暗培養，后給予光照培養。培養4周后，觀察不同處理的生長情況。結果見表1，在1/2 MS培養基中，6-BA濃度在1.0～3.0mg·L-1，隨著濃度的增加，發芽率越高，當6-BA濃度為4.0mg·L-1時，發芽率反而下降。在同一6-BA濃度下，相比MS培養基，1/2MS培養基比MS培養基發芽率均高。當培養基為1/2MS，6-BA的濃度為3.0mg·L-1，發芽率最高為82.61%，叢生芽長勢好。綜上所述，最適宜皺葉山姜芽誘導培養基為1/2 MS加6-BA 3.0mg·L-1加TDZ 2.0mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1。

表1 1/2 MS、MS培養基及6-BA濃度對叢生芽誘導的影響

2.2 增殖培養

用誘導形成的叢生芽轉接到增殖培養基上。在轉接時，要將新長出的葉片切掉，注意切時不要傷到生長點，將叢生芽轉接到增殖培養基上，30d后觀察芽增殖情況。

從表2可以看出，不同濃度6-BA和TDZ組合，對皺葉山姜組培增殖系數均有影響。在沒有添加任何激素的培養基上，芽的增殖系數最低為1.12，芽長勢弱，褐化較嚴重；當6-BA為1.0mg·L-1，叢生芽的增殖系數隨著TDZ濃度增加而增加，增殖系數最高為2.88；當6-BA為2.0mg·L-1時，TDZ濃度在0～2.0mg·L-1，增殖系數隨著TDZ濃度增加而增加，當TDZ濃度在3.0～4.0mg·L-1時，增殖系數反而下降。當6-BA濃度為2.0mg·L-1、TDZ濃度在2.0mg·L-1時，叢生芽增殖系為4.04，叢生芽生長健壯。綜上所述，最適的增殖培養基為1/2 MS加6-BA 2.0mg·L-1加TDZ 2.0mg·l-1加NAA 0.1mg·l-1。

表2 激素濃度配比對叢生芽增殖的影響

2.3 生根培養

當叢生苗長有3～4片葉子，并且高為3cm時，轉接到生根培養基上進行培養，在轉接時，要將叢生的小苗一株株分開，已長出的根系切掉。小苗培養30d后，統計生根率及根系生長情況。結果見表3，當培養基中沒有添加NAA時，植株生根率為86%，為所有培養基中生根率最低。當NAA濃度為0.1mg·L-1時，生根率達到99%，植株長勢健壯，根多且粗。當NAA濃度為0.2mg·L-1時，生根率反而下降，且NAA濃度越高，生根率反而下降。綜上所述，最佳生根培養基為1/2 MS加NAA 0.1mg·L-1。

圖1 叢生芽 圖2 生根小苗

表3 NAA的濃度對皺葉山姜的影響

3 討論與結論

植物組織培養和快繁技術已應用于姜科花卉及姜科藥用植物種苗的快繁中[10-13]。不同物種在組織培養過程中，對基本培養基的要求也不同。組織培養最常用的基本培養基是MS和1/2 MS，兩者的區別在于大量元素含量，在配置培養基時，1/2 MS是將MS大量元素減半，其他元素不變。本研究選用MS和1/2 MS培養基作為皺葉山姜芽誘導的基本培養。試驗表明，在同一添加植物生長調節劑的條件下，1/2 MS培養基誘導效果比MS培養基誘導效果好。

植物生長調節劑是指具有激素活性的人工合成的化學物質，已被廣泛應用于農業、林業及園藝作物，并獲得了顯著效果，其在組織培養中起著關鍵的作用。為了促進植物體的快速生長，在培養基中加入植物生長調節劑，誘導培養是組織培養成功的關鍵，增殖培養是獲得更多植株的基礎，生根培養是提高植株移栽成活率的重要因素。本試驗在1/2 MS培養基中加入6-BA 3.0mg·L-1、TDZ 2.0mg·L-1和NAA 0.1mg·L-1對誘導皺葉山姜吸芽產生叢生芽時效果最好；6-BA 2.0mg·L-1、TDZ 2.0mg·L-1濃度最適合叢生芽增殖生長，TDZ濃度過高或過低則不利于皺葉山姜叢生芽增殖；NAA濃度對皺葉山姜生根有很大的影響，不添加NAA和高濃度的NAA生根率較低，本試驗中NAA濃度為0.1mg·L-1時生根率最高，根系生長健壯。

以皺葉山姜吸芽為外植體，通過研究1/2 MS、MS基本培養基、激素及其濃度對芽的誘導、增殖及生根培養的影響，篩選出最佳培養基，最佳誘導培養基為1/2 MS加6-BA 3.0mg·L-1加TDZ 2.0mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1，增殖培養基為1/2 MS加6-BA 2.0mg·L-1加TDZ 2.0mg·L-1，生根培養基為1/2 MS加NAA 0.1mg·L-1。