低強度脈沖超聲在正畸骨改建中的研究進展

李律元，夏倫果，李佳宜，譚 宇，房 兵

正畸治療2～3年的漫長治療周期給患者和醫生都造成了諸多不便，研究者們正不斷致力于開發促進牙移動的方法以縮短正畸的治療周期。從生物學角度來說，正畸牙移動的基礎是牙周組織及牙槽骨的改建，適當的生物學刺激可促進牙周組織及牙槽骨的改建，牙移動速度隨之加快。目前，可用于加速正畸牙移動的方法主要有三類，分別為外科手術輔助法[1]、藥物治療法[2-5]和機械物理刺激法，然而，外科手術輔助法存在術后血腫、疼痛、感染的潛在風險，藥物治療法對全身其他系統造成的副作用尚不明確，這兩種方法各自的局限性限制了其臨床應用。既往研究顯示，骨細胞是力效應細胞，力學刺激可以引發骨改建活動，因此，機械刺激法現已成為極具應用前景的促進正畸牙移動的方法，其中，低強度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)近來逐漸受到研究者們的關注。

LIPUS是強度介于30～100 mW/cm2、頻率低于3 MHz的脈沖式超聲波。當LIPUS在人體介質中傳播時，超聲傳遞的能量使組織內發生壓力變化，細胞功能隨之改變[6-9]。當LIPUS作用于成骨細胞、牙周膜細胞及成牙骨質細胞時，其可發揮獨特的調控作用，最終在加速牙周組織的改建、加速正畸牙移動的同時，降低牙根吸收的風險。

1 LIPUS對骨組織改建的影響

在牙齒移動的過程中，受力牙齒周圍產生了張力區和壓力區。在張力側，成骨細胞數量增多，骨形成相關基因表達上調，骨新生活躍；在壓力側，破骨細胞增殖活躍，分泌細胞因子促使牙槽骨發生吸收。張力側與壓力側分別進行牙槽骨改建，使得牙齒在牙槽骨內發生移動。LIPUS可分別對張力側與壓力側的骨代謝進行調節，進而影響牙齒的移動。LIPUS在調節骨代謝過程中具有多重作用，廣泛調控成骨細胞的增殖、分化及骨基質礦化的過程。LIPUS可增加細胞鈣離子的內流，提高成骨細胞內NF-κB1和p38α的活性，進而激活mTOR信號通路，最終促進細胞的增殖[10]。骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)受到LIPUS刺激后，涉及成骨分化的多條信號通路如MAPK通路[11]、FAK-RhoA-YAP通路[12]、PI3K/AKT通路[13]激活，細胞內成骨標志基因OCN、OPN、ALP表達提高，BMSCs發生成骨向分化[14-15]。LIPUS刺激也使OPG/RANKL比值發生變化，BMSCs中OPG表達上升、RANKL表達下降，OPG/RANKL表達比例相應提高，進一步促進局部的骨再生[16]。LIPUS可提高細胞外基質礦化程度，Angle等[17]的研究結果表明，使用LIPUS連續刺激大鼠BMSCs 21 d后，基質礦化提高水平提高了82%。目前，頻率1.5 MHz、強度30 mW/cm2、20 min/d的LIPUS是骨科學中較為公認的利于骨愈合的超聲參數，應用這一參數的EXOGEN超聲系統已被美國FDA批準，應用于加速長骨骨折愈合。

LIPUS對于牙槽骨來源的BMSCs(alveolar bone derived mesenchymal stem cells, ABMSCs)具有類似的調控作用。LIPUS可通過激活PI3K/AKT通路刺激ABMSCs的增殖；細胞經LIPUS刺激后，基因CD29、CD44、COL1和OCN的表達水平明顯提高；對ABMSCs連續進行21 d的LIPUS刺激后，茜素紅染色結果表明超聲刺激的細胞外基質礦化程度顯著提高[18]。體內研究結果顯示，LIPUS應用于大鼠牙移動模型時，大鼠牙槽骨組織中成骨相關基因RUNX2及BMP2的表達上升[19]，隨著正畸牙移動，牙槽骨再生能力明顯增強，局部牙槽骨骨量顯著增加[20]。

LIPUS在調控破骨細胞功能中也發揮著重要的作用。LIPUS既可通過調控成骨細胞分泌細胞因子間接調控破骨細胞的功能，也可直接調控破骨前體細胞的分化。LIPUS可下調成骨細胞分泌細胞因子白細胞介素6(interleukin-6)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，二者均在破骨細胞早期的激活與分化中起到重要作用[21]；LIPUS 還可通過降低成骨細胞RANKL的分泌抑制破骨細胞的分化與成熟[16]。關于LIPUS對破骨細胞的直接作用，不同文獻間出現了分歧；一種結果認為LIPUS促進了破骨細胞的分化并提高了破骨細胞的活性，Carina等[22]的研究表明，LIPUS降低了小鼠巨噬細胞系RAW 264.7中組織蛋白酶K、MMP9及TRAP基因的表達，提示細胞破骨向分化受到抑制；Meng等[23]的研究結果同樣表明LIPUS抑制了破骨前體細胞的分化，他們將LIPUS 作用于小鼠巨噬細胞(bone marrow macrophages，BMMs)并同時進行破骨誘導，可觀察到TRAP陽性細胞數量下降及TRAP陽性面積減少，說明RANKL誘導的BMM破骨向分化能力下降，進一步研究其內在機制發現ERK/c-Fos/NFATC1信號軸激活。另一種結果顯示LIPUS增強了破骨細胞活性，Feres等[24]的實驗發現，在RANKL誘導的小鼠巨噬細胞系RAW 264.7破骨向分化過程中，如輔以LIPUS刺激，可增強其對碳酸鹽磷灰石的吸收能力。可見關于LIPUS對破骨細胞的影響，不同研究結果分歧較大，這值得進一步研究與探索。

LIPUS在調控骨代謝中的獨特作用使其在正畸臨床治療中的應用具有一定的可行性。最新研究結果顯示，LIPUS加速正畸牙移動的作用已獲得動物實驗研究結果的支持。欒俐陽等[25]發現，將LIPUS應用于大鼠正畸牙移動模型中， LIPUS刺激組大鼠從第7天起即表現出牙移動速度加快的跡象，局部組織中壓力側牙槽骨中破骨細胞數量增多，張力側牙槽骨骨新生活躍[17]；Arai等[20]研究發現，將LIPUS作用于大鼠正畸牙后，4周內牙齒移動距離為(6.36±0.13)mm，相比對照組的移動距離(6.23±0.09)mm顯著增加(P<0.05)，壓力側牙槽骨中的破骨細胞數量及張力側的牙槽骨量較對照組均明顯提升；Alazzawi等[19]的研究表明，LIPUS刺激的大鼠牙周組織中RANKL、RANK、OPG及RUNX2的表達水平升高，上調的成骨及破骨活性引起局部骨代謝速度加快，牙移動速度隨之加快，重建后的牙槽骨骨量亦有顯著提高。

正畸牙移動的體內試驗表明，壓力側牙槽骨中破骨細胞數量呈現增加的趨勢，這一現象在體外實驗未觀察到，可能是由于體外實驗無法模擬正畸治療壓力側的牙槽骨力學環境而導致。進一步有效模擬正畸治療中張力與壓力環境下的LIPUS引導成骨細胞及破骨細胞分化的實驗，對進一步研究LIPUS的生物作用機制具有重要的意義。

2 LIPUS對牙周膜改建的影響

在正畸牙移動過程中，牙周組織經歷著一系列改建變化。在正畸壓力側，牙周膜受到壓迫，牙周間隙變窄、血管受壓，基質及膠原纖維降解，破骨細胞分化形成并活躍運動；在張力側，基質及膠原纖維增生，成骨細胞增殖與分化增加，骨新生現象活躍。若在此過程中，如果牙周組織改建失衡，則會出現如牙周垂直骨高度降低或牙槽骨厚度減少的不良反應。因此，如何在正畸治療過程中保證患者牙周健康、減少牙槽骨量丟失，是臨床中亟待解決的問題。既往研究表明，LIPUS對牙周組織具有保護作用。牙周膜干細胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是一類存在于牙周膜內的干細胞，具有多向分化的潛能，在牙周組織的再生及改建中起著關鍵的作用，當PDLCs受到LIPUS刺激后，細胞內成骨分化蛋白表達水平提高，細胞發生成骨向轉化，引導骨組織再生。文獻報道，LIPUS可激活PDLCs中Integrin β1-AKT 信號通路，細胞內OCN、OPN、COL1、ALP等成骨相關基因的表達上調，細胞外基質鈣沉積增加[26-27]；Wang等[28]對犬PDLCs進行研究發現，LIPUS可提高細胞成骨向分化能力，BSP、OPN及COL-3的mRNA表達增加，將該參數的LIPUS應用于犬牙槽骨缺損模型中，連續處理8周后局部牙槽骨新生骨量增加，骨小梁的數量及厚度亦明顯提高；將LIPUS作用于牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts，HGF)也可觀察到類似的促成骨分化作用，LIPUS刺激后細胞內成骨分化標志物ALP及OPN的表達上升，但細胞的增殖能力未見明顯提高[29]。

LIPUS在抑制牙周組織炎癥反應中同樣發揮著不可忽視的作用。LIPUS作用于PDLCs后可抑制NF-κB信號通路的激活，下調細胞內炎癥因子IL-6、IL-8的表達[30-31]；牙周膜成纖維細胞(periodontal ligament fibroblasts，PDLFs)受到LIPUS刺激后，細胞內IL-1、IL-6、IL-8、RANKL基因的表達下降，趨化因子CCL2、CXCL1及CXCL10的表達亦同步下降[32]。可見適度的LIPUS刺激可抑制牙周組織的炎癥反應，牙周組織內溫和的炎癥反應可進一步促進局部骨組織的再生[33-34]。

3 LIPUS對牙骨質改建的影響

正畸誘導的牙根吸收(orthodontically-induced inflammatory root resorption，OIIRR)是正畸治療常見的并發癥之一，其多從根尖部開始發生，主要表現為牙根進行性地吸收，導致牙根變得短而鈍，當吸收到一定程度后則會影響牙齒的功能與穩定。牙根吸收的機制與骨吸收類似，若牙骨質周圍炎癥反應明顯、牙骨質的骨代謝平衡被破壞，則會新生大量破牙骨質細胞，吸收牙骨質組織。研究表明，LIPUS可有效緩解正畸引起的牙根吸收。Dalla-Bona等[35]研究發現，頻率為1 MHz、強度為30或150 mW/cm2的超聲可提高小鼠成牙骨質細胞系OCCM-30中Col1、ALP及OPG基因的表達，強度為150 mW/cm2時效果更佳。Inubushi等[36]發現，在大鼠正畸模型中，LIPUS刺激使牙根吸收長度及吸收面積下降，組織學檢測結果表明牙根中破牙破骨細胞數量減少，為進一步探索其中機制，Inubushi等將頻率為1 MHz、強度為30 mW/cm2的LIPUS作用于OCCM-30及小鼠成骨細胞系MC3T3-1，并施加7 kPa的壓縮力以模擬正畸過程中壓力側反應，發現OCCM-30細胞內OPG基因表達量顯著上升、RANKL基因表達受到抑制，該結果提示LIPUS可通過調控OPG/RANKL比值調控牙骨質代謝、促進牙骨質新生。值得注意的是，相同處理條件下，成骨細胞系MC3T3-1中RANKL基因表達量顯著上升、OPG/RANKL比值下降，提示骨代謝向破骨方向發展，這說明相同參數的LIPUS可在骨組織及牙骨質組織中產生不同效應。在正畸治療中，最佳反應應是骨組織發生活躍改建的同時牙骨質維持穩定，LIPUS在骨及牙骨質中產生的不同影響能使其同時滿足這兩個條件。

LIPUS緩解牙根吸收的效果在動物模型中得到證實。Al-Daghreer等[37]發現，經LIPUS處理后，比格犬正畸牙牙根表面吸收陷窩的數量及體積均有顯著下降，修復性牙骨質厚度較對照組增加，這與Crossman等[38]的實驗結果一致；Gul Amuk等[39]對經LIPUS刺激后的牙骨質組織進行檢測發現，組織中RANKL表達水平降低、OPG表達水平提高，環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表達量亦出現降低，說明炎癥反應水平有所下降。El-Bialy 等[40]使用隨機對照實驗對LIPUS減緩牙根吸收的作用進行驗證，他們招募21例正畸治療患者，使其在正畸治療過程中佩戴頻率為1.5 MHz、強度為30 mW/cm2的LIPUS設備，患者每4周拍攝一次CBCT以觀察牙根吸收及牙齒移動情況，分析CBCT可發現，對照組平均每周牙根吸收長度為(0.022±0.022)mm，經LIPUS刺激后可下降至(0.009±0.022)mm，牙根吸收程度顯著減輕，且每周牙移動距離由(0.266±0.092)mm提高至(0.232±0.085)mm，說明LIPUS在保護牙根的同時具有提高牙移動速度的效果。

Dahhas等[41]將LIPUS作用于骨質疏松大鼠的正畸牙移動模型中，發現實驗組牙根吸收長度及吸收量較單純骨質疏松正畸大鼠均有所降低，說明LIPUS對牙根的保護在伴有系統疾病時可能仍有效。因此，于正畸治療中應用LIPUS可在促進局部牙槽骨改建的同時，維持牙骨質的穩定、保證正畸牙的穩固，這對正畸治療預后的改善具有顯著的幫助。

4 總結與展望

綜上所述，LIPUS在正畸牙移動過程中，廣泛調控成骨細胞、牙周膜細胞與牙骨質細胞的功能，其主要生理功能有：①促進成骨細胞的增殖與成骨向分化，增加正畸張力側新生骨骨量；②抑制牙周組織中炎癥反應，促進牙周膜相關細胞成骨能力；③提高牙骨質組織中OPG/RANKL比值，減緩壓力作用下發生的牙根吸收。LIPUS的功能使其在正畸臨床治療中可發揮加速牙齒移動、保護牙根的作用，且由于其無創、安全的特點，其在臨床治療有重要的應用價值。