噬菌體對口腔疾病發生發展和治療的影響及機制

茍 冊，賈小玥，李雨慶，楊 燃，鄒 靜

病毒是人類口腔微生物群落中的重要組成部分，與口腔健康息息相關[1]，噬菌體是特異性感染細菌、真菌等微生物的病毒，由蛋白質外殼中包含DNA或RNA基因組成，是最主要的口腔病毒[2]。根據其生活方式的不同，噬菌體可分為毒性噬菌體(virulent phage)和溫和噬菌體(temperate phage)。毒性噬菌體，又稱為溶菌性噬菌體(lytic phages)，以裂解周期為特點，通過注入并復制其DNA導致宿主細胞裂解并釋放其子代噬菌體。溫和噬菌體，又稱為溶原性噬菌體(lysogenic phage)，啟動溶原性周期后，這種噬菌體可將其基因組整合到宿主細胞染色體中或將其維持為質粒，并隨宿主的繁殖不斷生成含有噬菌體的溶原性細胞。特定情況下溫和噬菌體也可能啟動裂解周期[3-4]。

噬菌體是口腔生態系統中穩定并具有特異性組成的部分，在人類口腔生態系統中具有重要作用[5-6]。噬菌體在口腔中廣泛分布，可與宿主相互作用保持口腔微生態的相對穩定。在牙周炎、齲病等口腔疾病中，相關噬菌體豐度顯著改變，提示噬菌體與部分口腔疾病的發生發展息息相關，但具體機制尚不清楚[6-7]，因此本文將對噬菌體在人類口腔微生物群落中的分布特點及其對口腔疾病發生發展和治療的作用和機制作一綜述，旨在為相關口腔疾病的發病機制及臨床治療提供新的思路。

1 噬菌體在口腔微生物群落中的分布特點

在早期研究中，Brady等通過電子顯微鏡觀察到牙菌斑中的病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)，提示口腔微生物群落存在噬菌體的可能性[8-11]。近年來，多項研究通過宏基因組學測序和重疊譜噬菌體群落(Phage Communities from Contig Spectrum, PHACCS)進一步分析，結果顯示人類口腔的微生物群落、牙菌斑和咽峽部微生物群落中均勻分布多種噬菌體[12]。噬菌體在口腔不同部位微生物群落中的分布具有特異性，可受氧氣、碳水化合物含量等因素的影響。牙齒的齦上區域生境中含有較多的碳水化合物和氧氣，噬菌體主要感染需氧菌，而齦下區域相較于齦上區域為無氧環境，噬菌體主要感染兼性厭氧菌[13]。

2 噬菌體與口腔菌群以及宿主的相互作用

口腔中最常見的噬菌體類型為長尾病毒科、肌病毒科和短尾毒科，長尾噬菌體(Siphoviridae)為溶原性病毒[14]。研究表明，溶原性噬菌體介導的移動遺傳元件對于口腔內抗生素耐藥性的傳播至關重要[15-16]。肌尾噬菌體(Myoviridae)和短尾噬菌體(Podoviridae)為溶菌性噬菌體，能迅速消除其易感宿主，對細菌具有更強的毒力，溶菌性噬菌體導致的細菌死亡占細菌死亡總數的20%～80%，因此溶菌性噬菌體在生物群落中的比例增加是極為重要的細菌限制因素[17]。

口腔噬菌體可以與口腔菌群相互作用，建立噬菌體-細菌感染網絡[18]。口腔噬菌體通過噬菌體-細菌感染網絡抑制或促進口腔致病菌的生長，參與口腔微生物群的演替過程。噬菌體-細菌感染網絡中的噬菌體分為特異性噬菌體和交叉感染噬菌體兩類。特異性噬菌體(specific phage)是僅侵襲一種細菌宿主的主要噬菌體類型，其入侵的短片段DNA僅與一類細菌的CRISPR高度相關，遵循一對一的感染模型。交叉感染噬菌體(cross-infective phages, CIP)則是與多種細菌種類有關的非宿主特異性噬菌體，遵循一對多模型，使細菌與噬菌體之間的通信復雜化[18]。

目前，噬菌體對口腔菌群的影響和作用機制尚不明確。特異性的溶原性噬菌體將自身基因整合至致病菌染色體，產生大量子代溶原性噬菌體及溶菌性噬菌體，裂解細菌。CRISPR/Cas系統是細菌針對噬菌體特有的免疫系統[19-20]，溶原性噬菌體可通過轉運自身限制/修飾酶等途徑來逃避該系統的同源序列[21-23]，從而使其長期持續存在于致病菌中[9,24]。特異性的溶菌性噬菌體可通過吸附、穿入特異性致病菌并合成子代噬菌體，進而裂解致病菌并釋放大量的細胞毒素與酶，引起免疫反應，造成口腔組織損傷[25]。口腔噬菌體與細菌之間相互作用，形成了復雜的噬菌體-細菌網絡，繼而通過多種形式影響口腔微生物群的演替過程。

3 噬菌體在口腔疾病發生發展中作用

3.1 牙周炎

牙周炎是由牙周致病菌誘導的發生于牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，可導致牙周組織破壞和患牙松動脫落[26-28]。研究發現，牙周炎患者口腔微生物群落中細菌和病毒的豐度均發生改變[21,29-30]。有學者等通過RNA測序分析牙周炎患者及牙周健康受試者的唾液樣本，研究結果發現牙周炎患者的溶菌素表達量顯著高于牙周健康受試者，而溶菌素是噬菌體的高表達產物，提示牙周炎患者口腔微生物群落中噬菌體豐度增加[1]。李飛等通過提取DNA并采用PCR及特異性引物檢測牙周炎患者及牙周健康受試者的齦下菌斑，研究結果發現噬菌體Req-DTP在牙周炎患者中的檢出率遠高于牙周健康者，證明噬菌體Req-DTP在牙周炎患者牙菌斑中豐度顯著增加[31]。

目前，噬菌體與牙周菌群的相互作用以及對牙周炎發生發展的影響和機制尚不清楚。此外，有研究顯示在牙周病模型中交叉感染噬菌體與牙周病原體之間呈顯著負相關，交叉感染噬菌體可感染多種致病菌并抑制病原菌的生長，降低致病菌的豐度，可能參與調控口腔微生態平衡[18]。有學者通過RNA測序牙周炎患者及牙周健康者的唾液、齦上及齦下生物膜樣本，發現牙周病患者較牙周健康者齦下菌斑內的肌尾噬菌體豐度增加，肌尾噬菌體屬于溶菌性噬菌體，提示牙周炎患者牙周微生物群落中噬菌體豐度的改變可能與牙周菌群改變有關[21]。另有研究顯示，牙周疾病的炎性環境激發細菌的相關應激反應，致細菌對酸性或堿性環境產生抵抗力，誘導某些溶原性噬菌體進入裂解周期，導致細菌裂解[1,29]。伴放線聚集桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans，Aa)在患有掌跖角化-牙周破壞綜合征兒童的快速毀滅性牙周炎的發病機理中起著關鍵作用，也是局限性青少年牙周炎(localized juvenile periodontitis，LJP)的疑似病原菌[32]。研究發現，在LJP患者的牙槽骨吸收部位的微生物群落中存在感染伴放線聚集桿菌的噬菌體。該噬菌體具有廣泛的宿主范圍，最終導致其宿主細菌的裂解，使牙周膜暴露于高濃度的內毒素、外毒素和酶中，并且裂解過程產生大量的有絲分裂原，其能夠在牙周膜中產生多克隆免疫反應造成牙周組織的快速破壞。這表明噬菌體、聚集桿菌和牙周組織的快速破壞之間存在密切聯系[25]。

3.2 難治性根尖周炎

難治性根尖周炎(refractory periapical periodontitis)是指根管治療失敗使根尖周感染持續存在，導致根尖周病變遷延不愈[33]。糞腸球菌是難治性根尖周炎的感染根管中最常見的微生物，通常是單一感染，是難治性根尖周炎的優勢致病菌[34-36]。研究表明，有30%～89%的牙齒根管治療后失敗的患者存在糞腸球菌感染[37-38]，其在營養匱乏的情況下可以長期生存，并對牙髓治療過程中常用的氫氧化鈣治療有抵抗力[39]。

研究發現，噬菌體可能參與了糞腸球菌介導的難治性根尖周炎病理過程。Stevens等從難治性根尖周炎根管中分離的10株糞腸球菌經過絲裂霉素C處理后，有4株產生了誘導性噬菌體。其中3種溶原性糞腸球菌菌株的噬菌體呈長尾噬菌體特征，另1株溶原性糞腸球菌菌株的噬菌體呈肌尾噬菌體的特征[40]。溶原性糞腸球菌菌株的遺傳物質由噬菌體的DNA序列片段所整合，每個糞腸球菌染色體包含多達7個整合的缺陷性噬菌體基因組[41]。包括質粒在內的噬菌體載體的遺傳信息還可以顯著改變其感染細菌的致病力，位于噬菌體載體上的基因可以編碼充當細菌毒素的蛋白質，該蛋白質可以改變宿主細胞抗原性，影響被膜和粘附因子的產生并增強血清抵抗力，從而增加了糞腸球菌的致病性及耐藥性[40,42-43]。

3.3 齲病

齲病(dental caries or tooth decay)是在以細菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發生慢性進行性破壞的一種疾病，是人類中最普遍和持久的疾病之一。變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是人類口腔中天然存在的革蘭陽性兼性厭氧球菌，是機會性病原體，大量研究證實為人類齲齒的主要致病菌[44]。迄今為止，已發現的S.mutans噬菌體有M102、M102AD、APCM01、e10和f1[45-46]。

Al-Hebshi等通過16S rRNA測序分析有齲及無齲兒童的齦上菌斑樣本，研究結果發現有齲患兒齦上菌斑中S.mutans噬菌體M102含量明顯高于無齲患兒[47]，提示S.mutans噬菌體可能參與了兒童齲病的發生發展。此外，有研究發現噬菌體M102對S.mutans中數量最多的血清型C具有特異性，往往與其宿主共同被發現，由此認為噬菌體M102可作為S.mutans血清型C的標志，亦可通過此種特性考慮其成為齲病潛在的防治措施[46-47]。

4 噬菌體在口腔疾病治療中的應用

4.1 牙周炎的治療

噬菌體療法可通過裂解性噬菌體特異性殺滅病原細菌，以替代抗生素[48]。具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)是一種革蘭陰性厭氧菌，與牙周疾病的發展和進程直接相關[49]。有學者在口腔中發現屬于Siphoviridae家族的噬菌體Fnp02，可高度特異性感染具核梭桿菌亞種，并且噬菌體Fnp02基因組具有高水平的甲基化，對限制性內切酶具有高抵抗力，可以保護其DNA[50]。Fnp02可通過特異性殺滅病原細菌影響牙周致病菌具核梭桿菌的豐度，有望作為新型生物控制劑，為牙周炎的臨床治療提供新的思路[27]。

4.2 難治性根尖周炎的治療

難治性根尖周炎具有一定的臨床治療難度，與糞腸球菌生物膜的抗感染性以及多種耐藥菌株等因素相關。Khalifa等[51]通過全基因組測序發現糞腸球菌噬菌體EFDG1，屬于肌尾噬菌體，EFDG1在根管感染的體外實驗模型中能高效地感染和殺死浮游和生物膜的糞腸球菌，并且EFDG1不攜帶任何在其他糞腸球菌噬菌體中已發現的毒力基因，例如毒素或抗生素抗性基因。EFDG1噬菌體療法是目前較為有前景的難治性根尖周炎治療方法，尤其在生物膜和多藥耐藥菌株導致的常規抗生素治療失敗時作為輔助治療策略[51]。另有研究通過噬菌體Ef11/FL1C(Δ36)PnisA處理糞腸球菌感染的牙本質，發現該噬菌體可顯著減少萬古霉素敏感菌株和萬古霉素耐藥的糞腸球菌菌株[37-38]。并且Khalifa等發現噬菌體EFDG1能非常有效地消除一個厚100 μm的糞腸球菌生物膜，7 d內生物膜減少量為未處理生物膜的5倍，證明噬菌體對生物膜的破壞率較高[52]。

4.3 齲病治療

Dalmasso等分離出S.mutans的高度溶菌性噬菌體APCM01，APCM01可在低至2.5×10-5的感染復數(multiplicity of infection)下，數小時內抑制培養基或人工唾液中的S.mutans生長，降低其代謝活性，提示噬菌體APCM01可作為抑制主要致齲菌S.mutans的一種潛在生物療法[45]。徐晶晶等收集重度低齡兒童齲患者牙菌斑標本，分離培養出S.mutans和遠緣鏈球菌(Streptococcussobrinus，S.sobrinu)，用噬菌體離心出的噬菌體裂解酶ClyR對其進行殺菌活性測試，發現ClyR可在細菌細胞壁上打孔，從而使細菌發生滲透性死亡，證明ClyR對S.mutans和S.sobrinus均有較強的殺菌作用，或許可以作為一種防齲藥物應用于臨床[53]。Delisle等分離出噬菌體M102及其編碼的抗菌酶，以漱口水、凝膠、表皮軟膏、牙膏等制劑作為載體，來抑制口腔中細菌(主要是鏈球菌)的形成，從而達到齲齒的預防[54]。

4.4 口腔黏膜病的治療

噬菌體可應用于口腔黏膜疾病或創傷的治療。結核病是一種由結核分枝桿菌復合群(mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)感染所引起的傳染病，其口腔臨床表現主要為結核性口腔潰瘍。李宏鳴等采用包含對MTBC敏感的噬菌體Actiphage軟膏局部涂抹，用于輔助治療結核性口腔潰瘍，噬菌體Actiphage的溶菌作用對口腔病變處結核桿菌的增殖有一定的抑制作用[55]。

角化細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)是一種促進上皮細胞增殖的特異性生長因子。Li等通過抗角化細胞生長因子抗體篩選出具有高結合活性的包含KGF片段的噬菌體，進一步發現2種能與人口腔黏膜上皮細胞(human oral mucosal epithelial cells，HOMEC)的KGF受體相結合的KGF樣噬菌體模型肽，后者可促進體外HOMEC增殖并且無致瘤作用，亦對傷口感染有一定抑制作用，提示KGF樣噬菌體模型肽可作為促進口腔黏膜傷口愈合的潛在方法[56]。此外，另有研究通過噬菌體展示技術構建KGF噬菌體活性肽，后者對口腔癌放療術后所導致的放射性口炎有一定治療作用[57]。

4.5 其他

噬菌體亦可應用于口腔疾病的預防。持續使用包含噬菌體(或其酶)的制劑，如漱口水、凝膠、表皮軟膏、牙膏等，可減少口腔疾病相關病原體數量、維持口腔微生物穩態，進而減少口腔疾病的發生[54]。另有研究表明，噬菌體裂解懸浮液加入軟膏、乳膏等制成的固體或半固體制劑均能對口腔機會性致病菌有穩定的裂解能力[58]。此外，噬菌體可作為潛在的疫苗傳遞載體，通過直接接種表面攜帶有疫苗抗原的噬菌體或將DNA疫苗表達盒整合到噬菌體基因組進行傳遞，為通過噬菌體疫苗預防口腔疾病提供可能性。

此外，噬菌體還可作為研究口腔微生物組的工具。噬菌體具有特異性和安全性，可與組學技術結合使用，分離出目標菌種，以研究復雜的體外混合生物膜模型以及動物和人體內的復雜聯合模型[59]。

5 總結和展望

噬菌體是人類口腔最主要的病毒類型，健康口腔中有大量噬菌體存在，噬菌體在調節口腔微生物群落穩態和口腔疾病的發生發展中起關鍵作用。近年來，人們已經認識到噬菌體在現代生物技術工業中具有多種潛在應用，包括蛋白質和DNA疫苗的運輸工具、基因治療的載體、抗生素的替代品、病原菌檢測工具或篩選蛋白質、肽或抗體文庫的工具。

噬菌體在口腔疾病的預防和治療中有良好的應用前景，與傳統的抗生素治療相比，噬菌體療法具有許多優勢：①噬菌體感染具有特異性，其感染范圍從幾個菌種到一個以上密切相關的屬；②噬菌體存在于宿主時的自我繁殖能力較高，這意味著較少劑量可能足以控制致病菌的感染；③抗生素和噬菌體之間不存在交叉耐藥性，使得噬菌體成為治療抗生素耐藥菌的有前景的解決方案；④噬菌體易分離，其制劑成本較抗生素更低；⑤與抗生素相比噬菌體破壞生物膜的效率更高[6,30,60]。

但噬菌體療法仍需面對很多問題：隨著噬菌體制劑的使用，可能會導致抗噬菌體細菌的進化發展；并且噬菌體作為病毒，能導致革蘭陰性菌裂解并釋放大量內毒素，對機體存在毒性；其次大多數噬菌體具有高度的免疫原性，可促進強烈的免疫反應，導致噬菌體被快速清除或者產生過敏反應[30]。

口腔中噬菌體是普遍存在的，大量臨床研究和動物實驗已證實噬菌體與口腔疾病的發生發展有關，當前研究顯示部分噬菌體對口腔疾病確實有一定的療效，但事實上目前只有很少數的能夠感染并消滅口腔細菌的對應噬菌體被分離[6]。因此，相關噬菌體的分離及其對口腔疾病的治療尚需進一步深入的研究，期待更多的證據以及更多的研究發揮其優勢、優化其弊端，使其廣泛應用于人類口腔疾病的預防和治療中。