禽源食品中沙門菌現場檢測方法的研究進展

張 帥,江海洋

(中國農業大學動物醫學院獸醫公共衛生安全全國重點實驗室,北京 海淀 100193)

沙門菌是自然界中普遍存在的一種食源性致病菌,是重要的人獸共患病原菌之一[1]。因飲食習慣等因素,西方人感染的食源性致病菌中以沙門菌最為常見,其中50%～75%的媒介是加工不完全的肉、蛋等動物源性食品產品[2]。沙門菌血清型眾多,Chen等[3]的報道顯示,與人類、動物、鳥類、嚙齒動物和爬行動物相關的沙門菌的血清型已經超過2 500種。明確常見的禽沙門菌血清型對于檢測來說至關重要。禽源食品中報道較為頻繁的沙門菌血清型有鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌和雞白痢沙門菌,近期報道的還有海德堡沙門菌、肯塔基沙門菌、嬰兒沙門菌和印第安納沙門菌[4]。

據測算,我國每年因食用雞肉導致的沙門菌食物中毒的發病人數達300多萬人次,其中近半數與生雞肉的交叉污染有關;我國居民廚房案板生熟分開的比例低(不足三成),未生熟分開的居民僅有半數用消毒劑清洗案板;用消毒劑清洗案板,發病人數可降低120萬人次[5]。同樣,使用清洗劑和消毒劑可以降低蛋殼表面細菌污染水平,但是消毒劑會造成另外的食品安全問題,或者使生產成本增加[6]。目前,我國國家標準規定,肉制品和即食用蛋制品中不允許檢出沙門菌[7]。沙門菌檢測方法的“金標準”是傳統的生化培養法,檢測步驟為預增菌、增菌、分離、生化試驗和血清型鑒定5個步驟,此法是所有檢測方法所得結果是否準確的參照,但從采樣到出結果需要36 h甚至更長時間,不能滿足食品安全快速檢測的需求[8,9]。

要達到防止污染擴大化的目的,需要進行現場實時檢測,及時確定被沙門菌污染的食品和批次并采取相關措施。本文就近年來新發展的適用于現場檢測禽源食品中沙門菌的方法和技術進行綜述,并探討食源性致病菌動態監測體系的建設和發展。

1 禽源食品感染沙門菌現狀

近年來,沙門菌引起的人類群體感染事件依舊頻發。在美國,僅2021年就發生多起沙門菌感染事件,其中因冷凍裹雞粉中存在腸炎沙門菌,導致36人感染,11人住院;因使用被沙門菌污染的火雞粉導致33人感染,4人住院[10]。2015年以來,我國每年因沙門菌導致的食物中毒發病人數約達300萬人次,其中近半數與生雞肉交叉污染有關[11]。

相對于其他食物種類,家禽導致的沙門菌感染病例約占19.0%,雞蛋約占14.8%[12]。因為飼養成本低且可以供食新鮮的蛋和肉,散養家禽普遍存在,其帶來的污染風險不能忽視。沙門菌可通過多種媒介污染家禽,包括嚙齒動物、貓和昆蟲以及受污染的垃圾[13,14],散養雞因缺乏管理,會接觸到這些媒介,處理不當就會感染人類。除了養殖源頭,在家禽屠宰和運輸過程中,沙門菌也會感染肉和蛋。

2 可用于現場檢測禽源食品中沙門菌的方法

2.1 基于分子生物學的快速檢測 以分子生物學技術為基礎的聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR),通過對不同血清型沙門菌的DNA保守序列設計引物進行擴增,產物通過瓊脂糖凝膠電泳,可根據電泳條帶進行結果判定。在PCR技術的基礎上發展形成了環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),其不僅具備PCR技術的高靈敏度和高特異性,而且反應條件溫和,可以相對減少沙門菌增菌培養時間,更易實現現場檢測。

Priya等[15]研究了一種基于LAMP的產物顯色測定法,可以用于目視檢測沙門菌擴增產物,在沒有任何富集的情況下檢測限為 0.9 CFU/g。Hu等[16]開發了一種針對腸炎沙門菌特異性基因的擴增檢測方法,使用 Genie Ⅲ小型儀器約35 min即可獲得擴增曲線和結果。Zhang等[17]研究了通用接頭PCR觸發的鏈置換擴增反應,建立了一種靈敏度高且可視化的鼠傷寒沙門菌檢測方法,恒溫擴增后直接顯色,肉眼即可判定結果,無需電泳,節省時間。因分子生物學檢測方法靈敏度高,若能結合有效的DNA提取方法,即可進行現場檢測。Antonia等[18]建立了一種簡化的 DNA 分離方法,適用于在現場快速提取細菌DNA,可與上述方法結合使用,實現沙門菌的現場檢測。

2.2 基于免疫學的快速檢測 在食源性微生物的檢測中,通過抗原和抗體特異性結合的快速檢測方法被廣泛研究和應用,主要的檢測方法是酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和側流免疫層析(Lateral flow immunoassay,LFIA),因其操作簡單、不使用復雜儀器的特點,更適用于快速檢測。但是,傳統免疫學檢測方法對食源性致病菌的靈敏度低,為了保持良好的特異性和穩定性,需要不斷提高和優化抗體的質量和試驗溶液體系。近年來,也有很多在此基礎上對沙門菌進行快速檢測的研究,主要目的是提高檢測的靈敏度。

Gao等[19]應用脲酶的誘導作用形成銀殼沉積在金納米粒子表面,以改進ELISA的比色速率,快速靈敏地檢測沙門菌,檢測限達到1.21×102CFU/mL。Wu等[20]制備了鼠傷寒沙門菌單克隆抗體1B4,以此為基礎開發的膠體金免疫層析試紙條對鼠傷寒沙門菌檢測的視覺靈敏度達4×105CFU/mL。Ren等[21]研發了一種可用于現場快速檢測腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的測流層析方法,其中鹽誘導聚集的金納米粒子作為信號探針用于信號放大,以改善T線的敏感性和特異性,可在 14 min內完成檢測,其視覺靈敏度為1×103CFU/mL。

2.3 基于生物傳感器的快速檢測 近年來,生物傳感器被廣泛應用于快速檢測食源性致病菌。生物傳感器是將生物信號和物理或化學換能器結合并轉化為可以監測信號的一類裝置,其靈敏度高,體積小。對于沙門菌的檢測主要是以抗原抗體或核酸適配體的特異性識別為基礎,將生物信號放大并轉化為光、電信號,通過建立信號強度與沙門菌濃度之間的關系判斷檢測結果,達到檢測的目的[22]。

Jiang等[23]開發了一種帶有自驅動聚對苯二甲酸乙二醇酯芯片的便攜式印跡電化學傳感器,用于快速檢測沙門菌,帶有虹吸管入口的芯片與反應室連接,經過創新設計實現自驅動進樣和檢測,檢測限為100 CFU/mL,可在 20 min內檢測出沙門菌,可應用于現場監測食品加工過程和食品流通過程中的沙門菌污染。Qi等[24]開發了一種微流體生物傳感器,將混合、分離、標記和檢測集成到單個微流控芯片上,使用具有酶活性的金屬有機框架和樹莓派(Raspberry Pi,RPi)來放大并分析生物信號,檢測雞肉中的鼠傷寒沙門菌,檢測限為 14 CFU/mL,這種生物傳感器有自動化程度高、反應速度快、所用試劑少和體積小等優點,有望用于食源性細菌的現場檢測。Yin等[25]的研究將沙門菌特異性invA基因在規律成簇的間隔短回文重復-核酸酶(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas12a,CRISPR-Cas12a)系統作用下形成脫氧核酶,可以在氯化血紅素存在下催化四甲基聯苯胺氧(Trimethylbenzene,TMB)反應,產物在 454 nm 處的吸光度增加而發生顏色變化,該生物傳感器結合智能手機比色測定,可對沙門菌進行超靈敏檢測,檢測限為1 CFU/mL,是用于病原菌即時檢測的新設計。

3 總結與展望

對于禽源食品中沙門菌的檢測,在注重快速的同時,還要強調現場檢測技術。無論是養殖場還是商場超市,只要能現場取樣進行快速檢測并出具結果,就可以在感染早期控制擴散,降低損失。而且,現場檢測可以最大限度保持樣本的原始性,可以從食品源頭控制沙門菌污染,減小運輸過程中帶來的不可控感染,使檢測結果更準確。

極少量的食源性致病菌經過繁殖后才會引起相關疾病,為快速準確地檢測活菌,檢測前的增菌是必要的,其也是整個檢測過程中最耗時的一步。現場檢測時,沙門菌存在于復雜的基質中,增菌后將其從蛋白質、脂肪和非目標菌中準確的甄別和捕獲頗有難度。高效率的富集和捕獲樣品前處理方法可以縮短增菌時間。若沒有樣本前處理方法可以有效解決增菌或者富集問題,下游的檢測技術將無法更好地發揮作用。Wang 等[26]研究發現,碳點-適配體復合物可作為一種新型熒光探針,用于定量檢測雞蛋樣品和自來水樣品中的鼠傷寒沙門菌,檢測限為50 CFU/mL,無需任何樣品富集過程,適用于現場檢測。Du[27]等開發了一種基于原位富集培養的有效預處理方法,大大減少了增菌時間,結合液滴數字聚合酶鏈反應技術實現快速檢測痕量沙門菌,可檢測出低至 10-1CFU/mL 水平的沙門菌,用8 h完成包括前處理在內的整個檢測過程。

Aliakbar Ahovan等[28]總結了微生物檢測的理想化狀態,即需要較短的分析時間(最好小于1 h),最少的操作技能,較高的穩定性,可檢測單個細菌,可區分活細胞和死細胞,沒有非特異性,不需要任何富集過程,若應用于實際環境檢測,還需控制檢測成本。目前,我國對于禽肉原料中沙門菌的限量沒有明確規定,但是,禽肉在禽養殖場、運輸、加工、儲存和售賣等環節都有被沙門菌污染的風險,而且這些過程相當復雜,需要在每個關鍵點進行現場檢測和監控,以防控代替治療,大大降低養殖成本并減小損失。目前來看,需要整合各方面的研究成果,獲得更高效的樣品前處理方法,結合具有良好性能的生物傳感器,形成靈敏且智能的檢測終端,結合大數據的分析系統和預警系統形成智能化檢測體系,從養殖源頭到餐桌全鏈條的每個關鍵點進行實時監測,對沙門菌在禽源食品中的污染進行有效的防控。