鹽霉素聯合X射線照射對食管癌ECA109及TE13細胞增殖及細胞周期的影響

摘要：目的" 研究鹽霉素聯合X射線照射對人食管癌ECA109及TE13細胞增殖及細胞周期的影響。方法" 取對數生長期的ECA109及TE13細胞，將其分為對照組、不同濃度鹽霉素組、6 Gy X射線照射組以及不同濃度鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組。在干預后24、48 h后，采用CCK-8法檢測各組細胞增殖率。然后取對數生長期的ECA109及TE13細胞，將其分為對照組、0.1 μmol/L鹽霉素組、0.5 μmol/L鹽霉素組、6 Gy X射線照射組和0.1 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組、0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組，采用流式細胞術檢測各組ECA109及TE13細胞的細胞周期。結果" 0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、50、100 μmol/L鹽霉素組干預24、48 h后ECA109細胞及TE13細胞增殖率低于對照組（Plt;0.05）;0.1、0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組干預24、48 h后ECA109及TE13細胞增殖率均低于6 Gy X射線照射組（Plt;0.05）;0.1、0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組ECA109細胞及TE13細胞G0/G1期細胞比例低于對照組、0.1 μmol/L鹽霉素組、0.5 μmol/L鹽霉素組及6 Gy X射線照射組，0.1、0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組ECA109細胞及TE13細胞G2/M期比例高于對照組、0.1 μmol/L鹽霉素組、0.5 μmol/L鹽霉素組及6 Gy X射線照射組（Plt;0.05）。結論" 鹽霉素對ECA109及TE13細胞均具有增殖抑制作用，且呈濃度和時間依賴性。鹽霉素和X射線聯合作用的抑制效果明顯優于二者單獨作用，其機制可能與鹽霉素聯合射線聯合引起ECA109及TE13細胞G2/M期阻滯有關。

關鍵詞：鹽霉素;食管癌;增殖抑制;細胞周期

中圖分類號：R735.1" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.07.016

文章編號：1006-1959（2023）07-0090-06

Effect of Salinomycin Combined with X-irradiation on Proliferation

and Cell Cycle of Esophageal Cancer ECA109 and TE13 Cells

ZHANG Yong-qin，ZUO Yun，WANG Shao-kai，CHEN Zhi-peng，LU Wei-dong，XU Zhen

（Department of Oncology，the Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University，Suzhou 215600，Jiangsu，China）

Abstract：Objective" To study the effect of salinomycin combined with X-ray irradiation on the proliferation and cell cycle of human esophageal cancer ECA109 and TE13 cells.Methods" ECA109 and TE13 cells in logarithmic growth period were divided into control group， salinomycingroup of different concentrations， 6 Gy X-ray irradiation group and salinomycin combined with 6 Gy X-ray irradiation group. CCK-8 method was used to detect the cell proliferation rates in various groups at 24 and 48 h after treatment. ECA109 and TE13 cells in logarithmic growth phase were divided into control group， 0.1 μmol/L salinomycin group， 0.5 μmol/L salinomycin group， 6 Gy X-ray irradiation group， 0.1 μmol/L salinomycin combined with 6 Gy X-ray irradiation group and 0.5 μmol/L salinomycin combined with 6 Gy X-ray irradiation group. The cell cycle percentage of ECA109 and TE13 cells in each group was detected by flow cytometry.Results" "The proliferation rates of ECA109 cells and TE13 cells in 0.1， 0.25， 0.5， 1， 2.5， 5， 10， 50 and 100 μmol/L salinomycin groups were lower than those in control group at 24， 48 h after intervention （Plt;0.05）. The proliferation rates of ECA109 and TE13 cells in the 0.1 and 0.5 μmol/L salinomycin combined with 6 Gy X-ray irradiation groups were lower than those in the 6 Gy X-ray irradiation group after 24 and 48 h of intervention （Plt;0.05）. The proportion of G0/G1 phase cells in ECA109 cells and TE13 cells in 0.1 and 0.5 μmol/L salinomycin combined with 6 Gy X-ray irradiation groups was lower than that in control group， 0.1 μmol/L salinomycin group， 0.5 μmol/L salinomycin group and 6 Gy X-ray irradiation group; the proportions of ECA109 cells and TE13 cells in G2/M phase in 0.1 and 0.5 μmol/L salinomycin combined with 6 Gy X-ray irradiation groups were higher than those in control group， 0.1 μmol/L salinomycin group， 0.5 μmol/L salinomycin group and 6 Gy X-ray irradiation group （Plt;0.05）.Conclusion" Salinomycin can inhibit the proliferation of ECA109 and TE13 cells in a concentration-dependent and time-dependent manner， and the combined effect of salinomycin and X-ray is better than that of the two alone， the mechanism may be related to the G2/M phase arrest of ECA109 and TE13 cells caused by the combination of salinomycin and X-ray.

Key words：Salinomycin;Esophageal cancer;Proliferation inhibition;Cell cycle

在全球范圍內，食管癌的發病率和死亡率均位于前10，其中一半以上的食管癌新發病例集中在我國[1]。據報道[2]，我國食管癌的發病率居第6位，死亡率居第4位。盡管近年食管癌診斷、治療技術不斷進步，但預后仍然很差，5年生存率不足30%[3]。由于食管癌早期癥狀不明顯，約70%的食管腫瘤患者確診時臨床分期已為中晚期，錯失手術切除機會，這些患者通常需要采取放化療為主的綜合治療以控制腫瘤進展，改善患者生存時間[4]。目前食管癌對于放化療耐受的機制仍不明確，其治療仍是臨床難點。因此，尋找能增加食管癌細胞放療敏感性的藥物，提高食管癌患者對放療的敏感性，改善患者生存質量并延長患者的生存時間尤為重要。鹽霉素系一類一元羧酸聚醚類動物專用抗菌藥物，屬于離子載體抗生素。近年來，在多種腫瘤中發現鹽霉素具有抗腫瘤作用，其可激活胃癌細胞自噬[5]，破壞腸癌細胞增殖、分化微環境[6]，通過調節自噬、誘導乳腺癌細胞凋亡[7，8]等。此外，有研究表明[9，10]，鹽霉素通過細胞內活性氧的釋放、線粒體損傷、內質網應激、AKT1-mTOR信號通路等多種途徑發揮癌細胞自噬調節及凋亡誘導作用。同時，鹽霉素能夠逆轉腫瘤細胞放療抵抗及多重耐藥[11]。本研究通過研究鹽霉素單獨或鹽霉素聯合X射線共同干預對食管癌ECA109及TE13細胞的增殖抑制作用及其對食管癌細胞周期的影響，探討鹽霉素是否具有放射增敏作用，以期為食管癌的治療提供策略和理論依據。

1材料與方法

1.1主要試劑" 胎牛血清購自美國Gibco公司;RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司;胰蛋白酶購自上海生物技術有限公司;CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所;鹽霉素購自美國Selleckchem公司;Annexin V-FITC/PI雙染色法流式細胞檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所。

1.2主要儀器" 倒置顯微鏡（日本Olymbus公司，BX-40）;酶標儀（美國Bio Rad公司，680型）;流式細胞儀（美國BD公司，FACS ARIA）;醫用直線加速器（美國Varian公司，23EX）。

1.3 細胞培養" 食管癌ECA109及TE13細胞獲贈于江蘇省人民醫院，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養箱中培養，每2～3 d傳代1次。

1.4照射條件" 室溫環境，采用醫用直線加速器6MV X線垂直照射，源靶距100 cm，照射野面積15 cm×15 cm，吸收劑量率為570 cGy/min。照射時，細胞上方加培養基，厚度為1.5 cm，使劑量建成在細胞層上。

1.5 CCK-8法檢測鹽霉素對食管癌細胞增殖的影響" 取對數生長期細胞，接種于96孔細胞培養板，每孔4×103～6×103個細胞，每孔終體積100 μl，待細胞貼壁后，分別加入終濃度為0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、50、100 μmol/L的鹽霉素，每組設6個復孔。同時，設調零組（僅加入RPMI 1640培養基100 μl）及對照組（僅加入單細胞懸液），然后繼續培養24、48 h后，棄去藥物，應用PBS清洗1～2遍，每孔加入100 μl新鮮培養液，再向每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續孵育2 h，用酶標儀在波長490 nm處檢測吸光度（A）值。按照以下公式計算細胞增殖率：細胞增殖率=（加藥組A值-調零組A值）/（對照組A值-調零組A值）×100%。計算鹽霉素作用后食管癌細胞的增殖抑制率。

1.6 CCK-8法檢測鹽霉素聯合X射線照射對食管癌細胞增殖的影響" 將對數生長期細胞接種于96孔細胞培養板，每孔4×103～6×103個細胞，每孔終體積100 μl，待細胞貼壁后，分別加入終濃度為0.1、0.5 μmol/L的鹽霉素，每組設6個復孔。同時，設調零組（僅加入RPMI 1640培養基100 μl）和對照組（僅加入單細胞懸液）。加入鹽霉素作用24 h，然后洗去藥物，接著調零組、對照組及加藥組均給予6 MV X射線垂直照射6 Gy，照射后繼續培養24、48 h，加入PBS，清洗1～2遍，每孔加入100 μl新鮮培養液，再向每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續孵育2 h，用酶標儀在波長490 nm處檢測吸光度（A）值。按照以下公式計算細胞增殖率：細胞增殖率=（加藥組A值-調零組A值）/（對照組A值-調零組A值）×100%。計算鹽霉素聯合射線作用后食管癌細胞的增殖抑制率。

1.7流式細胞術檢測細胞周期" 將處于對數生長期的單細胞懸液接種于6孔細胞培養板中，每孔1.5×105個細胞，分為對照組、0.1 μmol/L鹽霉素組、0.5 μmol/L鹽霉素組、6 Gy X射線照射組、0.1 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組和0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組（加入0.1和0.5 μmol/L鹽霉素24 h后給予6 Gy X射線照射）。培養72 h后收集細胞，離心棄上清，加入500 μl預冷的PBS重懸細胞，再加入1000 μl預冷的無水乙醇置于4 ℃固定過夜。PBS洗去固定液，加入100 μl RNase，37 ℃水浴30 min，加入400 μl PI染色，4 ℃避光30 min，然后上機檢測，分析實驗結果。實驗重復3次。

1.8統計學方法" 采用SAS 8.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，以Plt;0.05表示差異有統計學意義，Plt;0.01表示統計學意義顯著。

2結果

2.1鹽霉素對食管癌ECA109及TE13細胞增殖的影響" 0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、50、100 μmol/L鹽霉素組干預24、48 h后ECA109細胞及TE13細胞增殖率低于對照組（Plt;0.05），見表1。

2.2鹽霉素聯合X射線照射對食管癌ECA109及TE13細胞增殖的影響" 0.1、0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組干預24、48 h后ECA109及TE13細胞增殖率均低于6 Gy X射線照射組（Plt;0.05），見表2。

2.3鹽霉素對ECA109及TE13細胞周期的影響" 0.1、0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組G0/G1期細胞比例低于對照組、0.1 μmol/L鹽霉素組、0.5 μmol/L鹽霉素組及6 Gy X射線照射組，0.1、0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組G2/M期比例高于對照組、0.1 μmol/L鹽霉素組、0.5 μmol/L鹽霉素組及6 Gy X射線照射組（Plt;0.05），見圖1、圖2。

3討論

雖然醫療技術不斷創新發展，疾病的診療水平日益提高，但食管癌的治療效果仍然不理想，目前食管癌患者5年生存率不足30%[3]。放射治療在食管癌治療過程中發揮著重要作用，但由于腫瘤細胞的輻射抗性以及正常組織細胞對射線的耐受性，治療效果仍不理想。因此，通過干預增加食管癌細胞對放療的敏感性具有非常重要的意義[12]。

多項研究表明[13-16]，鹽霉素在體內外實驗中具有抑制腫瘤細胞生長的作用，且對機體的細胞毒性較低。本研究結果顯示，0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、50、100 μmol/L鹽霉素組干預24、48 h后ECA109細胞及TE13細胞增殖率低于對照組（Plt;0.05），提示鹽霉素可以抑制食管癌ECA109、TE13細胞增殖，呈時間和濃度依賴性。0.1、0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組干預24、48 h后ECA109及TE13細胞增殖率均低于6 Gy X射線照射組（Plt;0.05），提示鹽霉素和電離輻射聯合作用對ECA109、TE13細胞的增殖抑制更加明顯，表明電離輻射聯合鹽霉素后對食管癌細胞的毒性作用加強。此外，0.1、0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組ECA109細胞及TE13細胞G0/G1期細胞比例低于對照組、0.1 μmol/L鹽霉素組、0.5 μmol/L鹽霉素組及6 Gy X射線照射組，提示鹽霉素能夠誘導ECA109、TE13細胞發生G0/G1期阻滯，使細胞停滯在DNA合成前期，進而抑制腫瘤細胞的增殖。另有研究也發現[17-19]，鹽霉素能夠誘導視網膜母細胞瘤細胞發生G1期阻滯。Tyagi M等[20]研究發現，鹽霉素可誘導乳腺癌細胞DNA損傷，同時誘導乳腺癌細胞G1期阻滯。細胞周期指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，分為間期和分裂期2個階段，其中間期又分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。處于細胞周期的不同階段，腫瘤細胞對射線的敏感性也不一樣，一般認為腫瘤細胞處于G2/M期時對放療最敏感，G1期次之，S期敏感性最低[21]。因此，如果可以使腫瘤細胞處于對射線敏感的細胞周期時相，就能夠增加細胞的放療敏感性。Zhang L等[22]應用流式細胞技術研究了恩度對人肺癌A549細胞的影響，結果發現恩度可以增強肺癌A549細胞的放射敏感性，這可能和恩度使A549細胞阻滯于G2/M期相關。張曉英等[23]研究顯示，X射線可導致口腔癌細胞發生G2/M期阻滯。也有研究發現[24]，細胞周期蛋白酶抑制劑THZ1聯合X射線時，G2/M期細胞明顯增加，G0/G1期細胞明顯減少。本研究通過對各組細胞周期檢測發現，0.1、0.5 μmol/L鹽霉素聯合6 Gy X射線照射組ECA109細胞及TE13細胞G2/M期比例高于對照組、0.1 μmol/L鹽霉素組、0.5 μmol/L鹽霉素組及6 Gy X射線照射組，提示單純電離輻射和鹽霉素聯合電離輻射均能誘導ECA109、TE13細胞發生G2/M期阻滯，細胞被阻滯在對射線更為敏感的G2/M期。鹽霉素與X射線聯合作用的效果明顯優于鹽霉素單獨作用，對ECA109、TE13細胞的抑制作用更強，這其中細胞周期的變化很可能是引起上述現象的因素之一，詳細機制尚需從細胞凋亡、細胞自噬和DNA損傷修復等方面進行深入的研究。

綜上所述，鹽霉素對ECA109、TE13細胞具有增殖抑制作用和放射增敏作用，并呈濃度和時間依賴性，鹽霉素和X射線的聯合抑制效果明顯優于二者單獨應用，其機制可能是二者聯合作用引起ECA109、TE13細胞發生G2/M期阻滯。因此，鹽霉素聯合X射線照射可能提高食管癌患者治療效果，為食管癌的治療提供了新的思路。

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收稿日期：2022-06-13;修回日期：2022-06-27

編輯/杜帆

基金項目：張家港市衛計系統青年科技項目（編號：ZJGQNKJ201707）

作者簡介：張永芹（1983.1-），女，江蘇連云港人，碩士，副主任醫師，主要從事腫瘤放化療診治及研究

通訊作者：左云（1965.1-），女，江蘇揚州人，博士，主任醫師，主要從事腫瘤放化療診治及研究