銀杏葉、瓜蔞、丹參及配伍制劑對兔心肌缺血再灌注損傷的保護作用

摘要：目的" 以兔血液指標的波動和心肌組織病變為切入點，評價銀杏葉丹參湯主要成分單體及配伍對心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的保護作用。方法" 將新西蘭兔50只隨機分為模型對照組、銀杏葉組、瓜蔞組、丹參組和配伍組，10只/組。各給藥組灌胃給予相應藥物，模型對照組給予等體積純化水，持續1周。通過結扎兔冠脈左前降支30 min后再灌注120 min，制備心肌缺血再灌注損傷模型。檢測造模前、缺血30 min和再灌注120 min兔血液一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB）水平。HE染色觀察心肌組織病理變化，凋亡細胞原位末端轉移酶標記法（TUNEL）檢測心肌細胞凋亡率。結果" 瓜蔞組MIRI 120 min血清NO含量、NOS活性高于模型對照組（Plt;0.05）;配伍組缺血30 min、MIRI 120 min，銀杏葉組MIRI 120 min血清NO含量均低于模型對照組（Plt;0.05）;瓜蔞組心肌缺血30 min、MIRI 120 min，丹參組和配伍組MIRI 120 min血清SOD活性均高于模型對照組（Plt;0.05）;銀杏葉組MIRI 120 min及丹參組缺血30 min血清MDA含量均低于模型對照組（Plt;0.05）;丹參組缺血30 min兔血清IL-6含量高于模型對照組（Plt;0.05）;模型對照組MIRI 120 min血清IL-6含量低于丹參組，高于瓜蔞組（Plt;0.05）;銀杏葉組、瓜蔞組和配伍組MIRI 120 min血清TNF-α含量均高于模型對照組（Plt;0.05）;銀杏葉組、丹參組和配伍組缺血30 min，銀杏葉組、瓜蔞組、丹參組和配伍組MIRI 120 min血清CK-MB含量低于模型對照組（Plt;0.05）;銀杏葉組、瓜蔞組、丹參組和配伍組MIRI兔心肌的凋亡率低于模型對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。結論" 銀杏葉、丹參、瓜蔞及其配伍制劑均可有效減輕MIRI兔心肌損傷，作用機制可能主要與抗氧化應激和調節炎癥反應有關，配伍制劑作用機制較各單體提取物復雜。

關鍵詞：銀杏葉;瓜蔞;丹參;配伍;心肌缺血再灌注損傷

中圖分類號：R96;R285" " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.07.014

文章編號：1006-1959（2023）07-0079-06

Protective Effect of Ginkgo Biloba， Trichosanthes Kirilowii Maxim， Salvia Miltiorrhiza Bunge

and Their Compatibility on Myocardial Ischemia Reperfusion Injury Rabbits

WU Xian-sheng，YANG Jia-jun，LIANG Yong-fen，YAN Yu-feng，ZHU Bi-lan，ZHAI Yong-huan，KUANG Shao-song

（Guangdong Medical Laboratory Animal Center，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

Abstract：Objective" To study the protective effect of Ginkgo Biloba， Trichosanthes Kirilowii Maxim， Salvia miltiorrhiza Bunge and their compatibility on myocardial ischemia reperfusion injury （MIRI） of rabbits through observing changes of blood index and cardiac tissue.Methods" A total of 50 conventional New Zealand rabbits were randomly divided into model control group， Ginkgo Biloba group， Trichosanthes Kirilowii Maxim group， Salvia Miltiorrhiza Bunge group and compatibility group， with 10 rabbits in each group. Each administration group was given corresponding drugs by gavage， and the model control group was given equal volume of purified water for 1 week. Myocardial ischemia-reperfusion injury model was prepared by ligating the left anterior descending coronary artery for 30 min and reperfusion for 120 min. The levels of nitric oxide （NO）， nitric oxide synthase （NOS）， superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and creatine kinase isoenzyme （CK-MB） in blood were detected before modeling， 30 min after ischemia and 120 min after reperfusion. The pathological changes of myocardial tissue were observed by HE staining， and the apoptosis rate of myocardial cells was detected by TdT-mediated dUTP nick-end labeling （TUNEL）.Results" The serum NO content and NOS activity in the Trichosanthes Kirilowii Maxim group were higher than those in the model control group at 120 min after MIRI （Plt;0.05）. The level of serum NO in the compatibility group at 30 min of ischemia， 120 min of MIRI and 120 min of MIRI in the Ginkgo Biloba group was lower than those in the model control group （Plt;0.05）. The serum SOD activity of myocardial ischemia 30 min， MIRI 120 min in the Trichosanthes Kirilowii Maxim group and MIRI 120 min in the Salvia Miltiorrhiza Bunge group and compatibility group was higher than that in the model control group （Plt;0.05）. The level of serum MDA in Ginkgo Biloba group at 120 min of MIRI and Salvia Miltiorrhiza Bunge group at 30 min of ischemia was lower than those in model control group （Plt;0.05）. The content of serum IL-6 in Salvia Miltiorrhiza Bunge group was higher than that in model control group （Plt;0.05）. The content of serum IL-6 at 120 min of MIRI in the model control group was lower than that in the Salvia Miltiorrhiza Bunge group and higher than that in the Ginkgo Biloba group （Plt;0.05）. The content of serum TNF-α at 120 min of MIRI in Ginkgo Biloba group， Trichosanthes Kirilowii Maxim group and compatibility group was higher than that in model control group （Plt;0.05）. The levels of serum CK-MB in Ginkgo biloba group， Salvia Miltiorrhiza Bunge group and compatibility group at 30 min of ischemia， and Ginkgo biloba group， Trichosanthes Kirilowii Maxim group， Salvia Miltiorrhiza Bunge group and compatibility group at 120 min of MIRI was lower than that in model control group （Plt;0.05）. The myocardial apoptosis rate of MIRI rabbits in Ginkgo biloba group， Trichosanthes Kirilowii Maxim group， Salvia Miltiorrhiza Bunge group and compatibility group was lower than that in model control group， and the difference was statistically significant （Plt;0.05）.Conclusion" "Ginkgo Biloba， Trichosanthes Kirilowii Maxim， Salvia miltiorrhiza Bunge and their compatibility can reduce MIRI through regulating oxidative stress and inflammation， and mechanism of compatibility seems to be more complicated.

Key words：Ginkgo Biloba;Trichosanthes Kirilowii Maxim;Salvia miltiorrhiza Bunge;Compatibility;Myocardial ischemia reperfusion injury

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指心肌組織在短暫缺血后恢復血流而導致組織進一步損傷的現象，是人類健康和生活質量的重大威脅[1]，也是心血管疾病研究領域的熱點。在MIRI的預防和治療中，傳統中醫藥越來越受到人們的關注[2]。銀杏葉丹參湯是民間治療心絞痛、冠心病的偏方妙方，主要由銀杏葉、瓜蔞、丹參等中藥構成。其中丹參和瓜蔞作為傳統中藥材在中醫治療冠心病的方劑中使用頻率極高[3]，而銀杏葉在心腦血管疾病方面的保護作用也越來越受到人們的重視[4]。本研究通過研究銀杏葉丹參湯中主要成分及其配伍，探討其對心肌缺血再灌注的保護作用及機制。

1材料與方法

1.1實驗動物" 雄性新西蘭兔50只，普通級，3～4月齡，體質量2.2～2.6 kg，由廣東省醫學實驗動物中心（三水基地）提供，動物生產許可證號：SCXK（粵）2019-0035。動物飼養在廣東省醫學實驗動物中心普通級動物房，動物使用許可證編號：SCXK（粵）2018-0002，動物飼養條件：溫度18 ℃～26 ℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h晝夜明暗交替。動物實驗倫理由廣東省醫學實驗動物中心倫理委員會審批。

1.2藥品" 銀杏葉提取物、瓜蔞皮提取物、丹參提取物均由陜西海奧斯生物科技有限公司提供。速眠新Ⅱ[敦化市圣達動物藥品有限公司，國藥準字獸藥字（2014）070031777，規格：2 ml×10支]。舒泰50[法國維克有限公司，進口獸藥注冊證號：（2020）外獸藥證字06，規格：5 ml]。

1.3主要儀器和試劑" 生物機能儀（成都泰盟，BL-420S），冷凍離心機（科大創新，KDC-2046），全波長酶標儀（美國賽默，Multiskan Go）、紫外可見分光光度計（上海欣茂，UV-7504）。全自動生化分析儀（日本日立，7020）。一氧化氮（NO）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，20220406），一氧化氮合成酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，20220406），白細胞介素-6（IL-6）酶聯免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號R01012505）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號R02012506），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶聯免疫試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20220408），丙二醛（malondialdehyde，MDA）酶聯免疫試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20220408、20220403），肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB）檢測試劑盒（上海科華生物工程股份有限公司，20211012），凋亡細胞原位末端轉移酶標記法（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（Servicebio，G1507）。

1.4分組和給藥" 普通級新西蘭兔50只，以隨機區組法分為5組，10只/組，分別為模型對照組、銀杏葉組、瓜蔞組、丹參組和配伍組。銀杏葉組、瓜蔞組和丹參組分別以相應提取物按100 mg/kg體質量灌胃給藥，配伍組以三味藥提取物三味藥物每種50 mg/kg體質量灌胃給藥，1次/d，連續給藥7 d。

1.5造模" 兔術前禁食不禁水約12 h分別肌肉注射速眠新Ⅱ（0.04 ml/kg體質量）和靜脈注射舒泰50（0.6 mg/kg體質量）聯合麻醉新西蘭兔[5]。參考張磊等[6]發表的兔心肌缺血再灌注模型建立方法，在不進行氣管插管和使用呼吸機的情況下，通過結扎兔冠狀動脈左室支阻斷血流30 min，再恢復血流120 min制備MIRI模型。造模結束后，模型對照組、銀杏葉組、丹參組和配伍組各死亡1只動物，每組剩余動物例數n=9;瓜蔞組無動物死亡，動物例數n=10。

1.6取材和指標檢測" 造模前、結扎冠脈30 min和再灌注120 min分別采集兔血液，常溫放置約30 min后，以3500 rpm離心10 min，取血清測定NO含量、NOS活性、SOD活性、MDA含量、IL-6含量、TNF-α含量和CK-MB含量。再灌注120 min后，處死新西蘭兔，剖取心臟。取缺血部位進行病理檢查（HE染色）和TUNEL細胞凋亡檢查，以缺血部位凋亡細胞數量/心肌細胞數量作為心肌細胞的凋亡率。

1.7統計學方法" 使用Microsoft Excel和SPSS 21.0軟件進行統計分析，實驗數據以（x±s）表示。與同組造模前水平比較，采用t檢驗進行分析;多組比較符合正態分布且方差齊用單因素方差分析檢驗，若Plt;0.05，采用LSD法進行組間兩兩比較;如數據不符合正態分布或方差不齊則采用非參數檢驗。Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1對血液NO和NOS的影響" 模型對照組缺血30 min和MIRI 120 min兔血清NO含量均高于造模前，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）;瓜蔞組MIRI 120 min兔血清NO含量、NOS活性高于模型對照組，且高于造模前，差異有統計學意義（Plt;0.05）;配伍組缺血30 min、MIRI 120 min和銀杏葉組MIRI 120 min兔血清NO含量低于模型對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05）;模型對照組缺血30 min兔血液NOS活性低于造模前（Plt;0.05），見表1。

2.2對血液SOD和MDA的影響" 瓜蔞組心肌缺血30 min、MIRI 120 min，丹參組和配伍組MIRI 120 min兔血清SOD活性均高于模型對照組及同組造模前，差異有統計學意義（Plt;0.05）;銀杏葉組MIRI 120 min兔血清SOD活性高于造模前，差異有統計學意義（Plt;0.05）;模型對照組和丹參組MIRI 120 min兔血清MDA含量高于造模前，銀杏葉組MIRI 120 min及丹參組缺血30 min兔血清MDA含量均低于模型對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

2.3對血液IL-6和TNF-α的影響" 模型對照組、瓜蔞組和丹參組MIRI 120 min兔血清IL-6含量均高于同組造模前，差異有統計學意義（Plt;0.05）;模型對照組造模前兔血清IL-6含量高于瓜蔞組，低于丹參組，差異有統計學意義（Plt;0.05）;丹參組缺血30 min兔血清IL-6含量高于模型對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05）;瓜蔞組、丹參組、模型對照組MIRI 120 min兔血清IL-6含量均高于造模前，丹參組高于模型對照組，瓜蔞組低于模型對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05）;模型對照組和丹參組MIRI 120 min兔血液TNF-α含量均高于造模前，差異有統計學意義（Plt;0.05）;銀杏葉組、瓜蔞組和配伍組MIRI 120 min兔血液TNF-α含量均高于模型對照組，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

2.4對血液CK-MB的影響" 模型對照組、瓜蔞組、丹參組和配伍組缺血30 min兔血清CK-MB含量均高于造模前，銀杏葉組、丹參組和配伍組低于模型對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05）;各組MIRI 120 min兔血清CK-MB含量均高于造模前，差異有統計學意義（Plt;0.05）;銀杏葉組、瓜蔞組、丹參組和配伍組MIRI 120 min兔血清CK-MB含量均低于模型對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表4。

2.5對兔心肌組織病理的改變和心肌細胞凋亡的影響" 缺血范圍心肌組織HE染色結果顯示，模型對照組缺血部位心肌纖維排列紊亂，部分心肌細胞肥大、胞膜不完整，心肌纖維間隙變大、斷裂。與模型對照組比較，銀杏葉組、瓜蔞組、丹參組和配伍組心肌細胞排列略整齊，間隙明顯變小，心肌細胞肥大較模型對照組有改善，見圖1。與模型對照組比較，銀杏葉、瓜蔞、丹參和配伍制劑均可有效減少MIRI兔心肌的凋亡率，差異有統計學意義（Plt;0.05），見圖2、表5。

3討論

MIRI的發生機制多而復雜，目前認為MIRI的發生主要和氧自由基生成、炎癥反應、細胞凋亡、細胞內鈣超載以及線粒體通透性轉運孔道持續開放及線粒體自噬等有關[7]。銀杏葉丹參湯是治療冠心病和心絞痛的民間秘方妙方，有研究表明，其主要組成成分銀杏葉提取物具有抗氧化應激功能[4，8]，瓜蔞具有擴張冠狀動脈血管、抑制炎癥的功效[9，10]，丹參具有抗氧化應激、抑制鈣超載、抑制細胞凋亡等功效[11，12]。本研究通過研究3種中藥提取物單體及其配伍對MIRI的保護作用，探索了配伍制劑的可能性。

目前國內外對心肌缺血再灌注的研究多選擇大鼠，因動物個體較小，難以在MIRI發生過程中采集和檢測指標變化，同時因為造模過程中以呼吸機維持肺通氣容易引起肺部損傷干擾實驗指標。本研究以兔作為實驗對象，采集和監測MIRI發生過程中相關指標的變化。使用速眠新Ⅱ和舒泰50聯合麻醉[5]，以及采用改良MIRI造模方法[6]可減少手術過程兔呼吸抑制及肺部損傷對實驗結果的影響。

許秀秀等[13]在腦缺血再灌注的研究發現，腦部缺血區血流減少后大鼠血清NOS活性和NO含量增加，而藥物治療可穩定NOS活性和NO水平而發揮保護作用。本研究中，發生MIRI后，模型組動物血清NO含量升高，NOS活性未見明顯變化，與王秋靜等[14]報道的大鼠發生MIRI后NOS活性和NO含量均顯著下降不同。動物種屬的差異以及造模時動物肺部通氣功能可能是產生差異的主要原因。本研究結果顯示，銀杏葉具有穩定MIRI兔血清NO含量的功能，而瓜蔞則可能通過上調NOS活性和NO含量而具有較強的舒張血管的作用，與既往報道文獻一致[15]。

心肌在短暫缺血后，在突然恢復血流時會產生大量活性氧（ROS）和MDA，過多的MDA會消耗并導致SOD活性下降[16]。本研究中MIRI發生過程中，兔血清SOD活性均并未出現下降，而MDA含量出現顯著上升。研究結果提示瓜蔞、丹參提取物及配伍制劑均能有效提高血清SOD的活性，而僅有瓜蔞提取物對抑制血清MDA含量升高起效。

MIRI發生后，心肌細胞的壞死和損傷往往與炎癥因子的增多緊密相關[17]，其中TNF-α是評價炎癥反應的重要指標[18]。本研究結果顯示，瓜蔞提取物對IL-6和TNF-α均有較好的抑制作用，銀杏葉提取物和配伍制劑主要通過抑制TNF-α發揮抗炎作用，丹參提取物反而促進了IL-6的釋放。

CK-MB具有心肌的特異性，被認為是診斷心肌損傷和評價藥物對MIRI保護作用的重要標志[19]。本研究結果顯示，MIRI發生后，兔血清CK-MB會迅速升高，可用于早期心肌損傷的標志。銀杏葉、瓜蔞、丹參提取物及其配方干預后均可有效降低血清CK-MB含量，對MIRI兔心肌組織具有較好的保護作用。病理檢查和細胞凋亡結果表現出與CK-MB變化相似的趨勢。

本研究旨在對銀杏葉丹參湯的配伍制劑可能性及方向進行初步探討，研究中銀杏葉提取物和瓜蔞提取物表現出來對血管舒張的相反的作用和丹參提取物促進了IL-6釋放的原因均需要進一步研究和分析，而配伍制劑中各藥物成分的比例仍需要進行更多的摸索和調整。

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收稿日期：2022-06-09;修回日期：2022-06-19

編輯/肖婷婷

基金項目：1.廣東省中醫藥局科研項目（編號：20192012）;2.廣東省省級科技計劃項目（編號：2019A030317016）

作者簡介：吳賢生（1987.11-），男，廣西合浦縣人，碩士，主管藥師，主要從事藥效學、毒理學研究

通訊作者：鄺少松（1973.4-），女，廣東佛山人，博士，高級獸醫師，主要從事病理學、毒理學、獸醫學研究