基于加權基因共表達網絡分析方法識別A型急性主動脈夾層的樞紐基因及分子機制

摘要：目的" 利用生物信息學方法探究A型急性主動脈夾層（AAAD）的病理機制、關鍵靶點以及診斷生物標志物。方法" GEO數據庫下載GSE52093數據集，基于差異分析和WGCNA算法，構建基因共表達模塊，對關鍵模塊基因進行功能富集分析及PPI網絡分析，探究關鍵模塊基因參與AAAD的分子機制，并篩選出與AAAD密切相關的Hub基因。結果" 從GSE52093數據集中共鑒定出218個差異表達基因，其中上調基因135個，下調基因82個;另基于差異表達基因識別出4個基因模塊，包括Turquoise模塊（95個基因）、Blue模塊（91個基因）、Yellow模塊（20個基因）、Grey模塊（11個基因），其中Turquoise模塊與AAAD相關性最顯著。關鍵基因模塊在多種生物途徑中富集，包括肌動蛋白細胞骨架的調節（regulation of actin cytoskeleton）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）、黏著斑途徑（focal adhesion）、血管平滑肌收縮（vascular smooth muscle contraction）、心肌細胞中的腎上腺素能信號轉導（adrenergic signaling in cardiomyocytes）、Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）等。從PPI網絡中篩選出10個與AAAD密切相關的Hub基因，分別為ACTC1、ACTN4、NEXN、MYOZ2、CSRP1、PPP1R12B、RYR2、MYL9、ACTG2、CASQ2，這些Hub基因在AAAD中均表達下調。結論" 本研究利用生物信息學方法篩選出與AAAD密切相關的生物途徑和Hub基因，將為AAAD病理機制研究以及診斷生物標物和治療靶點的發現提供基礎。

關鍵詞：A型急性主動脈夾層;樞紐基因;加權基因共表達網絡分析;生物信息學分析

中圖分類號：R543.1" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.07.002

文章編號：1006-1959（2023）07-0009-08

Identification of Hub Genes and Molecular Mechanisms of Type A Acute Aortic Dissection Based

on Weighted Gene Co-expression Network Analysis

GONG Dao-xing

（Department of Vascular Surgery，Changsha First Hospital，Changsha 410000，Hunan，China）

Abstract：Objective" To explore the pathological mechanism， key targets and diagnostic biomarkers of type A acute aortic dissection （AAAD） by bioinformatics methods.Methods" The GSE52093 dataset was downloaded from the GEO database. Based on the difference analysis and WGCNA algorithm， the gene co-expression module was constructed. The key module genes were subjected to functional enrichment analysis and PPI network analysis to explore the molecular mechanism of key module genes participating in AAAD， and Hub genes closely related to AAAD were screened.Results" A total of 218 differentially expressed genes were identified from the GSE52093 dataset， including 135 up-regulated genes and 82 down-regulated genes. In addition， four gene modules were identified based on differentially expressed genes， including Turquoise module （95 genes）， Blue module （91 genes）， Yellow module （20 genes） and Grey module （11 genes）， among which Turquoise module had the most significant correlation with AAAD. Key gene modules were enriched in multiple biological pathways， including regulation of actin cytoskeleton， calcium signaling pathway， focal adhesion pathway， vascular smooth muscle contraction， adrenergic signaling in cardiomyocytes， Wnt signaling pathway and so on. Ten Hub genes closely related to AAAD were screened from the PPI network， namely ACTC1， ACTN4， NEXN， MYOZ2， CSRP1， PPP1R12 B， RYR2， MYL9， ACTG2 and CASQ2， which were down-regulated in AAAD.Conclusion" In this study， bioinformatics methods were used to screen out the biological pathways and Hub genes closely related to AAAD， which will provide a basis for the study of the pathological mechanism of AAAD and the discovery of diagnostic biomarkers and therapeutic targets.

Key words：Type A acute aortic dissection;Hub genes;Weighted gene co-expression network analysis;Bioinformatics analysis

急性主動脈夾層（acute aortic dissection，AAD）即主動脈內膜損傷破裂，血液進入中膜層，于主動脈兩層之間形成新的含血腔隙，是一種病情危重、發展迅速、病死率高的以胸背部劇烈疼痛為主要表現的主動脈疾病[1]。根據Stanford分型，急性主動脈夾層分為A型與B型兩類。A型急性主動脈夾層（type A acute aortic dissection，AAAD）主要累及主動脈弓、降主動脈及腹主動脈，大約占AAD的2/3[2]。由于主動脈瓣反流、心力衰竭和中風等嚴重并發癥，AAD死亡率較高[3]，而AAAD術后死亡率高達9.3%～28.6%。未接受任何治療的AAAD患者3個月死亡率約為90%，24 h內的自然死亡率達30%，48 h內的自然死亡率可達50%[4]。然而，由于AAAD的癥狀與肺栓塞、急性冠狀動脈綜合征和心肌梗死等疾病相似，經常會導致診斷不及時，影響患者生命健康[5]。因此，早期診斷對于患者獲得及時治療，改善預后至關重要。但目前臨床上缺乏有效且方便的診斷生物標志物，故識別新的潛在生物標志物對于AAAD的治療尤為重要。近年來越來越多的研究認為[6-9]，AAAD的發生和基因突變、主動脈結構異常、主動脈中層的退行性變、慢性炎癥等有關，但AAAD的病理機制仍不清楚。研究AAAD的分子機制，對于認識疾病的發生、發展和轉歸以及治療靶點的發現和靶向藥物的研發有著重要意義。隨著基因表達譜的發展，基于生物信息學方法，通過篩選病理和生理條件下差異表達基因，是尋找疾病的生物標志物以及病理機制和關鍵治療靶點的重要手段[10]。目前，通量測序技術已在AAAD的研究中廣泛使用，因此整合先進生物信息學方法是探究AAAD分子機制，尋找診斷生物標物和關鍵靶點的十分方便有效的途徑。本研究采用加權基因共表達網絡分析（WGCNA）對AAAD相關的表達譜芯片進行生物信息學分析，以期為AAAD病理機制研究以及診斷生物標物和治療靶點的發現提供基礎。

1資料與方法

1.1數據來源" 從GEO數據庫中下載AAD相關的基因表達譜數據集（GSE52093），GSE52093基于GPL10558（Illumina HumanHT-12 V4.0表達芯片），包含7個AAAD組織標本和5個相鄰正常組織標本。

1.2基因差異表達分析" 使用R軟件（版本3.6.3）BiocManager軟件包，分別對GSE52093數據集進行背景校正、標準歸一化處理和表達式值計算。以|log（FC）|≥1.0，Plt;0.05為閾值分析差異表達基因，并繪制火山圖進行可視化。

1.3WGCNA" R軟件包構建所有差異基因的WGCNA分析，具體流程包括：首先，選擇網絡建設的軟閾值。軟閾值是鄰接矩陣成為0到1之間的連續值，使構建的網絡符合冪律分布，更接近真實的生物網絡狀態;其次，使用blockwiseModules函數構建無標度網絡，然后進行模塊劃分分析，以確定基因共表達模塊，該模塊可以對具有相似表達模式的基因進行分組。這些模塊通過使用動態樹切割算法將聚類樹切割成分支來定義，并分配不同的顏色進行可視化;然后，計算每個基因模塊的特征值（ME）;接著，計算每個模塊中ME與臨床特征之間的相關性;最后，進一步計算模塊基因的基因顯著性。計算并篩選GSE52093數據集WGCNA分析下的關鍵模塊基因，用于后續分析。

1.4功能富集分析" 為了確定GSE52093數據集WGCNA分析下關鍵模塊基因的生物功能，使用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行功能富集分析。

1.5差異基因的相互作用" 使用String數據庫（http：//string-db.org），對關鍵模塊基因進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析。然后，通過CytoHubba插件篩選PPI網絡中的關鍵基因，以最大相關標準（maximal clique centrality，MCC）算法，從PPI網絡中篩選出得分最高的10個基因作為本次研究的Hub基因。

2結果

2.1差異基因表達分析" 對GSE52093數據集進行標準歸一化處理，從GSE52093數據集中共鑒定出218個差異表達基因，其中上調基因135個，下調基因82個，見圖1。

2.2 WGCNA網絡的構建" 分別對GSE52093數據集中差異基因進行WGCNA分析。設置WGCNA網絡的軟閾值為28，根據模塊相似度大于0.25標準合并相似模塊。基于GSE52093數據集差異表達基因識別出4個基因模塊，包括Turquoise模塊（95個基因）、Blue模塊（91個基因）、Yellow模塊（20個基因）、Grey模塊（11個基因），見圖2。基于Pearson相關性分析方法，通過計算各個基因模塊與樣本表型之間的關系，繪制出基因模塊與樣本表型熱圖，結果顯示Turquoise模塊與AAAD相關性最顯著，見圖3。

2.3功能富集分析" 利用DAVID數據庫對WGCNA分析下的95個Turquoise模塊基因進行GO注釋和KEGG功能分析，其中GO分析結果顯示，關鍵模塊基于涉及201種生物過程（biological process，BP）、33種細胞成分（cellular component，CC）、31種分子功能（molecular function，MF）3大類。BP涉及基于肌動蛋白絲的過程（actin filament-based process）、肌肉結構發育（muscle structure development）、肌動蛋白細胞骨架組織（actin cytoskeleton organization）、離子傳輸的調節（regulation of ion transport）、金屬離子遷移的調節（regulation of metal ion transport）、肌細胞分化（muscle cell differentiation）等過程。CC包括肌節（sarcomere）、肌原纖維（myofibril）、收縮纖維（contractile fiber）、肌動蛋白細胞骨架（actin cytoskeleton）、細胞-基底連接（cell-substrate junction）、細胞間連接（cell-cell junction）等。在MF中，共同的關鍵模塊基因主要富集于激酶結合（kinase binding）、肌動蛋白結合（actin binding）、激酶活性（kinase activity）、蛋白激酶結合（protein kinase binding）、轉錄因子結合（transcription factor binding）、鈣調素結合（calmodulin binding）、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）等分子功能。KEGG功能富集結果顯示，關鍵模塊基因富集于53條信號通路中，包括肌動蛋白細胞骨架的調節（regulation of actin cytoskeleton）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）、糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy）、黏著斑途徑（focal adhesion）、血管平滑肌收縮（vascular smooth muscle contraction）、心肌細胞中的腎上腺素能信號轉導（adrenergic signaling in cardiomyocytes）、Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）等。KEGG及GO分析各類別下前20條目見圖4。

2.4 Hub基因的PPI網絡構建及Hub基因的篩選" 使用String軟件對共同模塊基因進行PPI網絡分析。基于MCC算法，通過CytoHubba plugin從PPI網絡中篩選出相關度最大的前10個Hub基因，分別為ACTC1、ACTN4、NEXN、MYOZ2、CSRP1、PPP1R12B、RYR2、MYL9、ACTG2、CASQ2。與正常對照組相比，這些Hub基于在AAAD中均下調，其低表達可能與AAAD進程密切相關，見圖5、表1。

3討論

AAAD是一種嚴重的主動脈疾病，表現為內膜撕裂穿透升主動脈中膜，其發病機制復雜，與多種基因的相互調控有關。同時，由于缺乏快速、有效的診斷和治療方法，AAAD在臨床上具有很高的死亡率。因此，探究AAAD分子機制，尋找行之有效的診斷生物標物具有十分重要的意義。

本研究基于生物信息學方法，首先對GSE52093數據集進行差異分析和WGCNA分析，識別出與AAAD相關性最佳的關鍵模塊基因。對關鍵模塊基因進行功能富集分析，結果顯示這些模塊基因主要富集在肌動蛋白絲的過程、肌動蛋白細胞骨架組織、離子傳輸的調節等生物過程，肌動蛋白細胞骨架的調節、鈣信號通路、黏著斑途徑、血管平滑肌收縮、Wnt信號通路等信號途徑，該結果揭示了導致AAAD可能的生物途徑。

血管平滑肌細胞（VSMCs）是主動脈中膜的重要成員，具有收縮和合成2種細胞表型[11]。正常情況下，VSMCs多為合成表型，合成細胞外基質（包括膠原、彈性蛋白和蛋白聚糖等）維持主動脈正常彈性和張力。在AAAD中，VSMCs向收縮表型轉換，細胞凋亡作用增強，增殖和遷移能力減弱[12，13]。研究表明[14，15]，收縮型VSMCs可通過肌動蛋白絲形成過程、肌動蛋白細胞骨架組織形成及調節、黏著斑途徑等生物途徑介導AAAD的發生或發展。鈣信號通路在維持血管平滑肌正常生理功能中發揮著重要作用，當VSMCs中Ca2+濃度升高，將引起血管收縮，反之則導致血管舒張[16，17]。研究發現[18]，鈣信號通路受到過度抑制、VSMCs對Ca2+敏感性減弱，可導致血管收縮能力下降，引起主動脈中膜退化，使血管變得脆弱。

此外，本研究通過對模塊基因進行PPI網絡分析，結合MCC計算方法，候選出與AAAD相關的10個Hub基因，包括ACTC1、ACTN4、NEXN、MYOZ2、CSRP1、PPP1R12B、RYR2、MYL9、ACTG2、CASQ2。與正常對照組相比，這些Hub基于在AAAD中均顯著下調。已有研究報道[19]，NEXN、ACTG2、RYR2等基因在心血管疾病中發揮著重要作用。Wu L等[20]研究發現，NEXN可通過促進VSMCs增殖和遷移，改善主動脈損傷。Wang W等[21]研究發現，ACTG2可抑制VSMCs表型轉換，改善主動脈夾層。但目前相關研究仍非常缺乏，以上基因與AAAD的關系機制仍需進一步探索。

綜上所述，本研究利用生物信息學方法篩選出與AAAD密切相關的生物途徑和Hub基因，將為AAAD病理機制研究以及診斷生物標物和治療靶點的發現提供基礎。

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收稿日期：2022-06-09;修回日期：2022-08-22

編輯/杜帆

作者簡歷：龔道星（1990.4-），男，湖南華容縣人，碩士，住院醫師，主要從事胸腹主動脈瘤、下肢動脈缺血、糖尿病足、下肢靜脈曲張的研究