植物炭黑對(duì)九種水產(chǎn)致病菌的抑制和吸附效果

摘要：為研究植物炭黑對(duì)常見(jiàn)水產(chǎn)致病菌的抑制和吸附效果，采用瓊脂稀釋法測(cè)定植物炭黑對(duì)9種水產(chǎn)致病菌的最小抑菌濃度，并將受試菌懸液和不同濃度的植物炭黑混合，測(cè)定受試菌的吸附率、解吸附率和植物炭黑吸附力。結(jié)果表明，植物炭黑對(duì)溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）的MIC均為200 mg/mL，對(duì)遲緩愛(ài)德華菌（Edwardsiella tarda）MIC為12.5 mg/mL，對(duì)其他6種致病菌的MIC均為25 mg/mL；當(dāng)受試菌濃度為106 CFU/mL時(shí)，隨著植物炭黑濃度的增加，受試菌吸附率逐漸增大，至100%后保持不變，解吸附率逐漸減小，至0后保持不變，且當(dāng)植物炭黑濃度為2 mg/mL時(shí)，試驗(yàn)組受試菌的吸附率均可達(dá)100%，解吸附率均為0；當(dāng)受試菌濃度保持不變，植物炭黑濃度逐漸增加時(shí)，植物炭黑吸附力逐漸減小。因此，植物炭黑對(duì)常見(jiàn)水產(chǎn)致病菌具有較好的吸附效果，對(duì)淡水致病菌的抑制性強(qiáng)于海水致病菌。

關(guān)鍵詞：植物炭黑；水產(chǎn)致病菌；抑制；吸附

中圖分類(lèi)號(hào)：S965.117" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）06-0125-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.06.023 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Inhibition and adsorption effect of plant carbon black on 9 aquatic pathogenic bacteria

CHEN Bin1，LIN Yu1，F(xiàn)AN Hai-ping1，XUE Ling-zhan1，YUAN Li-hua2，ZHONG Quan-fu1

（1.Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian Province，F(xiàn)uzhou" 350002，China；

2.Fujian Fishery Technical Extension Center，F(xiàn)uzhou" 350003，China）

Abstract：In order to verify the inhibition and adsorption effect of plant carbon black on common aquatic pathogens， the agar dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration of plant carbon black on 9 aquatic pathogens， and the test bacteria suspension was mixed with different amounts of plant carbon black to determine the adsorption rate， desorption rate and adsorption capacity. The results showed that the MIC value of plant carbon black to Vibrio alginolyticus and Vibrio harveyi were both 200 mg/mL， the MIC value to Edwardsiella tarda was 12.5 mg/mL， and the MIC value of the other 6 pathogenic bacteria were all 25 mg/mL. When the concentration of the tested bacteria was 106 CFU/mL， with the increasing of the amount of plant carbon black， the adsorption rate of the tested bacteria gradually increased， and finally it remained unchanged to 100%. And the desorption rate gradually decreased， and finally remained unchanged to 0. When the concentration of plant carbon black was 2 mg/mL， the adsorption rate of every test group could reach 100%， and the desorption rate was 0. At the same time， The adsorption capacity of carbon black on the tested bacteria gradually decreased. Therefore， it could be determined that plant carbon black had a good adsorption effect on common aquatic pathogens， and its inhibitory effect on freshwater pathogens was stronger than that of seawater pathogens.

Key words： plant carbon black； aquatic pathogens； inhibition； adsorption

植物炭黑的主要成分為活性炭，其以天然植物秸稈為原料，經(jīng)過(guò)高溫碳化、活化后制得，已初步在中國(guó)食品工業(yè)和動(dòng)物飼料方面得到應(yīng)用。2015年5月24日實(shí)施的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定符合《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 植物炭黑》要求的植物炭黑可以作為食品添加劑、著色劑應(yīng)用到食品生產(chǎn)中。研究表明，植物炭黑具有吸附玉米赤霉烯酮的能力，大鼠飼糧中添加植物炭黑可以緩解玉米赤霉烯酮導(dǎo)致的大鼠生長(zhǎng)性能下降和繁殖系統(tǒng)紊亂［1］，仔豬飼糧中添加0.1%植物炭黑能緩解嘔吐毒素引起的斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和血清抗氧化能力的下降，抑制嘔吐毒素造成的空腸蔗糖酶活性的異常升高［2］，大刺鰍飼料中添加植物炭黑，顯著提高大刺鰍的酶活力和生長(zhǎng)速度［3］。目前，植物炭黑對(duì)水產(chǎn)致病菌的抑制和吸附效果的研究尚無(wú)報(bào)道。

水產(chǎn)病原菌抗藥性增加和水產(chǎn)品藥物殘留問(wèn)題是制約中國(guó)水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，越來(lái)越受到社會(huì)的廣泛關(guān)注。目前已有很多研究者將中草藥制劑、益生菌、免疫增強(qiáng)劑、生物漁藥等作為飼料添加劑替代抗生素應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中［4-6］。而植物炭黑具有綠色無(wú)污染、價(jià)廉易得、吸附性強(qiáng)、不參與機(jī)體代謝等特點(diǎn)［7］，適合應(yīng)用到水產(chǎn)的綠色養(yǎng)殖生產(chǎn)和疾病的防控過(guò)程中。因此，本研究以植物炭黑為材料，探索其對(duì)常見(jiàn)水產(chǎn)致病菌的抑制和吸附作用，為其在水產(chǎn)細(xì)菌性疾病的防控應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、遲緩愛(ài)德華菌（Edwardsiella tarda）、腦膜膿毒性伊麗莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）、無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）為福建省淡水水產(chǎn)研究所收集菌株，溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）來(lái)自福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站。

1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar，NA）、弧菌選擇瓊脂（Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，TCBS）均購(gòu)自海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 植物炭黑 植物炭黑由福建省順昌縣碳娃娃生物科技有限公司提供，主要成分為植物炭黑，以原木材加工中產(chǎn)生的杉木屑、松木屑和竹屑，以及中草藥植物白頭翁、艾葉、馬齒莧、魚(yú)腥草、鳳尾草等為原料，經(jīng)高溫碳化、活化等工藝后制得。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物炭黑對(duì)9種水產(chǎn)致病菌的抑菌性 采用瓊脂稀釋法［8］，將植物炭黑加入NA或TCBS培養(yǎng)基中，配制植物炭黑的濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200 mg/mL的培養(yǎng)基，對(duì)照組培養(yǎng)基不添加植物炭黑；配制受試菌懸液，濃度調(diào)整為107 CFU/mL；接種受試菌于不同濃度的植物炭黑平板上，接種后所形成的菌液圈直徑5～8 mm，每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)平行；接種后的培養(yǎng)基28 ℃倒置培養(yǎng)24 h。

結(jié)果判定：菌落生長(zhǎng)被完全抑制的最低抗懸液濃度為該樣品對(duì)受試菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.2.2 植物炭黑對(duì)9種水產(chǎn)致病菌的吸附性 配制受試菌懸液，濃度調(diào)整為106 CFU/mL；分別稱(chēng)取0、5、10、20、40 mg植物炭黑加入至50 mL的離心管中，編號(hào)為組1、組2、組3、組4、組5，其中組1為對(duì)照組，組2至組5為試驗(yàn)組，然后均加入10 mL受試菌懸液，28 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，每組植物炭黑濃度設(shè)置3個(gè)平行；取出離心管，靜置30 min，取上清液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)；吸附試驗(yàn)結(jié)束后，棄上清液，將剩余固體物加入10 mL生理鹽水，28 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，靜置30 min，取上清液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

結(jié)果判定：受試菌吸附率=（P2-P1）/（P2）×100%；受試菌解吸附率=（P3）/（P2-P1）×100%；植物炭黑吸附力（CFU/mg）=（P2-P1）/M［9］。

式中，P1為吸附試驗(yàn)試驗(yàn)組上清液中細(xì)菌濃度，P2為吸附試驗(yàn)對(duì)照組上清液中細(xì)菌濃度，P3為解吸附試驗(yàn)試驗(yàn)組上清液中細(xì)菌濃度，M為吸附試驗(yàn)中植物炭黑濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物炭黑的抑菌性

由表1可知，嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、惡臭假單胞菌、無(wú)乳鏈球菌、腦膜膿毒性伊麗莎白菌對(duì)植物炭黑的MIC均為25 mg/mL，遲緩愛(ài)德華菌對(duì)植物炭黑的MIC為12.5 mg/mL，溶藻弧菌和哈維氏弧菌對(duì)植物炭黑的MIC為200 mg/mL。9種致病菌中溶藻弧菌和哈維氏弧菌主要感染海水魚(yú)類(lèi)，其對(duì)植物炭黑的MIC遠(yuǎn)高于其他7種致病菌。

2.2 植物炭黑的吸附性

由表2可知，植物炭黑對(duì)9種受試菌均有明顯的吸附效果。隨著植物炭黑濃度的增大，受試菌吸附率逐漸增大，至100%后保持不變，解吸附率逐漸減小，至0后保持不變。當(dāng)植物炭黑濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí)，試驗(yàn)組受試菌吸附率均可達(dá)100%，受試菌解吸附率均為0。

由表2、表3可知，在9種受試菌中，當(dāng)受試菌吸附率遠(yuǎn)小于100%時(shí)，隨著植物炭黑濃度的增加，植物炭黑的吸附力逐漸降低，即單位體積的植物炭黑所吸附的菌體數(shù)量逐漸減少；當(dāng)受試菌吸附率達(dá)到100%后，植物炭黑濃度每增加1倍，吸附力約降低為原來(lái)的1/2，因植物炭黑過(guò)量，此時(shí)計(jì)算的吸附力值無(wú)效。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)所用植物炭黑的生產(chǎn)原料中包括白頭翁、艾葉、馬齒莧、魚(yú)腥草、鳳尾草等多種中草藥植物，中草藥成分均具有較好的抑菌和殺菌效果［10-14］。因此，試驗(yàn)中植物炭黑表現(xiàn)出的抑菌作用可能與所添加中草藥中抑菌成分有關(guān)。而且，有研究表明生物碳中含有大量的Na+、K+、Ca2+、Mg2+等離子，它們以氧化物或碳酸鹽的形式存在于灰分中，溶于水后呈堿性［15］，當(dāng)植物炭黑添加到培養(yǎng)基中時(shí)，增加了培養(yǎng)基的鹽度和pH，改變了細(xì)菌的最適生長(zhǎng)環(huán)境，對(duì)細(xì)菌也呈現(xiàn)一定的抑制作用。而溶藻弧菌和哈維氏弧菌均為嗜鹽弧菌，在一定的鹽濃度條件下才能正常生長(zhǎng)［16］，因此植物炭黑的添加對(duì)其抑制作用較弱，海水病原菌的MIC明顯高于淡水病原菌。

植物炭黑的主要成分是活性炭，微孔結(jié)構(gòu)多，具有較大的比表面積［17］，對(duì)有害物質(zhì)、病原菌、重金屬等都具有較強(qiáng)的吸附作用［7，18］。本試驗(yàn)中植物炭黑對(duì)9種水產(chǎn)致病菌的吸附作用明顯，當(dāng)受試菌濃度不變時(shí)，隨著植物炭黑濃度的增加，受試菌吸附率逐漸增大，至100%后保持不變，受試菌解吸附率卻逐漸降低，至0后保持不變，說(shuō)明植物炭黑濃度較低時(shí)對(duì)受試菌吸附不牢固、易釋放，植物炭黑濃度較高時(shí)對(duì)受試菌吸附牢固、不易釋放，可以利用王麗坤等［19］的研究結(jié)果進(jìn)行解釋?zhuān)串?dāng)被吸附物濃度較高時(shí)，分子間的作用和擁擠現(xiàn)象變得明顯，被吸附物的狀態(tài)為垂直取向，當(dāng)被吸附物濃度變低時(shí)，被吸附物的狀態(tài)變?yōu)槠椒∠颍椒∠蛭奖却怪比∠蛭浇佑|面大，吸附更牢固。

而當(dāng)被吸附物狀態(tài)為垂直取向時(shí)，吸附單位所占的表面積最小，吸附物單位表面有更大的吸附容量、吸附力大，被吸附物狀態(tài)為平伏取向時(shí)，吸附單位所占的表面積大，吸附物單位表面吸附容量變小，吸附力變小［19］，與本研究結(jié)果一致，即當(dāng)受試菌濃度保持不變，植物炭黑濃度逐漸增加時(shí)，植物炭黑的吸附力逐漸減小。

植物炭黑對(duì)7種淡水病原菌的抑制作用明顯強(qiáng)于2種海水病原菌，且植物炭黑對(duì)9種水產(chǎn)致病菌均有較強(qiáng)的吸附作用。因此，植物炭黑可以作為水質(zhì)改良劑或飼料添加劑應(yīng)用于淡水魚(yú)類(lèi)的養(yǎng)殖和病害防控中。

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收稿日期：2022-04-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家大宗淡水魚(yú)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-45-41）

作者簡(jiǎn)介：陳 斌（1986-），男，河南正陽(yáng)人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究，（電話(huà)）15705902453（電子信箱）1549361186@qq.com；通信作者，樊海平（1967-），男，江蘇常州人，研究員，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究，（電子信箱）fanhaiping16@163.com。