銀翹解毒片高效液相色譜指紋圖譜研究*

吳 琦，賈銀芝，2，劉益慶△，陳 紅

（1. 連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222006；2. 江蘇省食品藥品監督檢驗研究院連云港檢驗室，江蘇 連云港 222006）

銀翹解毒片源自清代吳鞠通《溫病條辨》中的銀翹散［1］，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹葉、甘草9 味中藥材組方，有疏風解表、清熱解毒功效，主要用于治療風熱感冒，癥見發熱頭痛、咳嗽口干、咽喉疼痛。2020 年版《中國藥典（一部）》以綠原酸和連翹苷為含量測定指標控制其質量［2］。目前對銀翹解毒片質量控制的研究，主要是利用高效液相色譜（HPLC）法測定綠原酸［3-4］、連翹苷［5］、連翹酯苷A［3，6-7］、牛蒡苷［3，5］、木犀草苷［3］、甘草酸［8］等的含量，也有研究采用毛細管電泳［9］（CE）法和HPLC［10-11］串聯紫外檢測器（UV）或二極管陣列檢測器（PDA）法建立銀翹解毒片的指紋圖譜。中藥指紋圖譜能整體反映中藥材或中藥制劑所含化學成分的種類和數量，因此，研究指紋圖譜對于制劑的質量控制十分必要。但UV 具有一定局限性，如處方中桔梗的主要成分桔梗皂苷D 不能被其檢出，故需要一種通用型檢測器作為補充。本研究中采用HPLC 與PDA 或蒸發光散射檢測器（HPLC - ELSD）聯合（HPLC - PDA 或HPLC - ELSD）技術建立了銀翹解毒片的指紋圖譜，為制劑的質量控制提供了新的方法和策略。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

E2695 型高效液相色譜儀、包括2998 型PDA 檢測器、2424 型ELSD 檢測器（美國Waters 公司）；BP211D 型電子天平（德國Sartorius 公司，精度為0.01 mg）；AE -100型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.1 mg）；IQ 7000 型純水機（美國Milli-Q 公司）；F-100SD 型超聲波清洗器（深圳福洋科技集團有限公司）。

1.2 試藥

銀翹解毒片（15批，11家企業生產，樣品信息見表1）；綠原酸（批號為110753-202018，含量96.1%），甘草苷（批號為111610-201908，含量95.0%），連翹酯苷A（批號為111810-202108，含量96.2%），木犀草苷（批號為111720-202111，含量96.6%），橙皮苷（批號為110721-202019，含量95.3%），連翹苷（批號為110821- 202117，含量94.9%），牛蒡苷（批號為110819 - 201812，含量95.0%），桔梗皂苷D（批號為111851 - 201708，含量97.9%），甘草酸銨（批號為110731 - 202122，含量94.4%）對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

表1 15批樣品信息Tab.1 Information of 15 batches of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫（0～5 min時8%A，5～25 min時8%A →17%A，25～34 min時17%A →18%A，34～57 min 時18%A →30%A，57～65 min 時30%A →38%A，65～72 min 時38%A，72～74 min時38%A →100%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL；PDA 檢測波長：230 nm；ELSD條件：漂移管溫度為75 ℃，氣體壓力為25 psi。

2.2 溶液制備

取綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A、木犀草苷、橙皮苷、連翹苷、牛蒡苷、桔梗皂苷D、甘草酸銨的對照品各約10 mg，精密稱定，分別置20 mL容量瓶中，加甲醇15 mL，超聲（功率600 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，放冷至室溫，用甲醇定容，搖勻，即得單一對照品溶液。

取樣品10 片，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷至室溫，再次稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取樣品（編號S7）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定6次，以32 號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果HPLC - ELSD 圖譜各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.29%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.21%（n=6）；HPLC-PDA 圖譜各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.38%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于2.37%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（編號S7）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1 項下色譜條件進樣測定，以32 號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，HPLC-ELSD圖譜各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.31%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.34%（n=6）；HPLC - PDA 圖譜各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.44%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于2.59%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（編號S7）適量，按2.2 項下方法平行制備供試品溶液6 份，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，以32號峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，HPLC-ELSD圖譜各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.56%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于2.52%（n=6）；HPLC-PDA 圖譜各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.64%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于2.75%（n=6），表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜建立

HPLC - PDA 指紋圖譜的建立：取15 批樣品適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，將各批樣品色譜峰分別進行積分，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版），以編號S7 樣品的色譜圖作為參照圖譜，剪切溶劑峰，選擇中位數法，時間窗設為0.2 min，采用多點校正法建立疊加指紋圖譜（見圖1），生成對照指紋圖譜（見圖2），根據匹配結果共標定35 個共有峰。各共有峰保留時間的RSD為0.03%～0.68%，峰面積的RSD為19.62%～87.12%，表明共有峰的出峰時間較穩定，但不同批次樣品成分含量波動較大。15 批樣品與對照圖譜的相似度結果見表2。僅1 批樣品（S13）的相似度小于0.9，表明不同廠家不同批次銀翹解毒片的相似性較好。

圖1 15批銀翹解毒片的高效液相色譜-二極管陣列檢測器疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC - PDA superimposed fingerprint of 15 batches of Yinqiao Jiedu Tablets

圖2 銀翹解毒片的高效液相色譜-二極管陣列檢測器對照指紋圖譜Fig.2 HPLC - PDA reference fingerprint of Yinqiao Jiedu Tablets

表2 15批銀翹解毒片樣品的相似度Tab.2 Similarity of 15 batches of Yinqiao Jiedu Tablets

HPLC - ELSD 指紋圖譜的建立：按上述方法建立HPLC-ELSD 疊加指紋圖譜（見圖3），生成對照指紋圖譜（見圖4）。共標定26 個共有峰，其中除36 號峰外均可與HPLC - PDA 指紋圖譜中的共有峰對應。15 批樣品中，各共有峰保留時間的RSD為0.04%～0.37%，峰面積的RSD為38.30%～88.81%，表明共有峰的出峰時間較穩定，但不同批次樣品的成分含量波動較大。15 批樣品與對照圖譜的相似度結果見表2。僅2 批（S9 及S13）樣品的相似度小于0.9，表明不同廠家不同批次銀翹解毒片的相似性較好。

圖4 銀翹解毒片的高效液相色譜-蒸發光散射檢測器對照指紋圖譜Fig.4 HPLC - ELSD reference fingerprint of Yinqiao Jiedu Tablets

2.5 共有峰的定性分析

取2.2項下單一對照品溶液及供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，比對指認色譜峰。HPLCPDA 色譜圖中鑒定出9 號峰為綠原酸，17 號峰為甘草苷，20 號峰為連翹酯苷A，21 號峰為木犀草苷，26 號峰為橙皮苷，30 號峰為連翹苷，32 號峰為牛蒡苷，35 號峰為甘草酸銨，詳見圖5。HPLC - ELSD 色譜圖中鑒定出36號峰為桔梗皂苷D，詳見圖6。

圖5 高效液相色譜-二極管陣列檢測器色譜圖9.Chlorogenic acid 17.Liquiritin 20.Forsythoside A 21.Luteoloside 26.Hesperidin 30.Phillyrin 32.Arctiin 35.Glycyrrhizic acid ammonium saltA.Test solution B.Chlorogenic acid reference solution C.Liquiritin reference solution D.Forsythoside A reference solution E.Luteoloside reference solution F.Hesperidin reference solution G.Phillyrin reference solution H.Arctiin reference solution I.Glycyrrhizic acid ammonium salt reference solutionFig.5 HPLC - PAD chromatograms

圖6 高效液相色譜-蒸發光散射檢測器色譜圖36.Platycodin DA.Test solution B.Reference solution of platycodin DFig.6 HPLC - ELSD chromatograms

3 討論

3.1 試驗條件選擇

預試驗中分別考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水3種流動相，結果顯示，以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫時，各成分分離效果較好。分別考察了溫度（30，35，40 ℃）和流速（0.8，1.0，1.2 mL / min）對色譜峰分離效果的影響，結果顯示，柱溫為30 ℃、流速為1.0 mL/min 時能使基線平穩，且分離度和峰形達到較好效果。同時采用PDA 進行紫外全波長掃描，兼顧各成分的檢測信號強度和檢測靈敏度，在230 nm 波長處色譜圖基線噪音較低，峰數目多，分離度較好，且基線穩定，故選擇230 nm 為檢測波長。對ELSD 漂移管溫度（70，75，80 ℃）和氣體壓力（20，25，30 psi）進行考察，最終確定漂移管溫度75 ℃、氣體壓力25 psi 為最優ELSD參數。

3.2 檢測器選擇

PDA 適用于有紫外吸收的化學成分，對于無紫外吸收的成分檢測具有一定局限性。ELSD 是通用型檢測器，不依賴被測成分的光學特性，可檢測無紫外吸收或紫外吸收較弱的成分。銀翹解毒片處方中桔梗的指標成分桔梗皂苷D 紫外吸收較弱，HPLC - ELSD 法較HPLC-UV法更適于桔梗皂苷D的含量測定［12］。2005年版《中國藥典（一部）》把2000年版及以前版本中列出的金銀花分列為金銀花和山銀花，在藥典收載變化后，部分廠家申請將處方中的金銀花變更為山銀花，但處方中含金銀花的制劑仍存在用山銀花投料現象［13-16］。山銀花含有金銀花所沒有的特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙，該成分紫外吸收較弱，藥典規定山銀花中灰氈毛忍冬皂苷乙的測定采用HPLC-ELSD 法，故將PDA 和ELSD合用，建立更全面的指紋圖譜的同時也對金銀花投料的規范性進行有效控制。

3.3 指紋圖譜分析

本研究中建立了銀翹解毒片的HPLC - PDA 和HPLC-ELSD 指紋圖譜，在PDA 和ELSD 下分別標定了35 個和26 個共有峰，通過對照品比對法指認了9 個共有峰。指紋圖譜相似度結果表明，11個廠家的15批銀翹解毒片樣品的相似性較好，但成分的含量存在顯著差異，說明生產所用藥材質量參差不齊，或者生產工藝轉移率不一致。

3.4 方法評價

本研究中所建立的HPLC-PDA-ELSD指紋圖譜，相較單一檢測法能更全面地反映制劑的指紋圖譜特征，該研究為銀翹解毒片的質量控制提供了一定參考。