檸檬酸三甲酯堿降解途徑及其雜質(zhì)結(jié)構(gòu)初步解析*

耿 燕，李香荷，王月英，王永欣，張 冬△

（1. 河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050200； 2. 河北省軍區(qū)石家莊第三離休干部休養(yǎng)所，河北 石家莊 050000）

檸檬酸三甲酯具有生物降解性好、無毒、揮發(fā)性小及抗細(xì)菌等優(yōu)點(diǎn)［1］，為環(huán)境友好型醫(yī)藥中間體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等各領(lǐng)域。工業(yè)生產(chǎn)上通常以檸檬酸經(jīng)酸催化進(jìn)行酯化反應(yīng)制得［2-4］，由于反應(yīng)中需產(chǎn)生3 個(gè)酯鍵，收率較低（多在74%～78%之間）。黃飛等［5］通過改良催化合成條件，收率最高可達(dá)89.6%。且其在堿破壞條件下最不穩(wěn)定，所產(chǎn)生的雜質(zhì)量最高［6］。常采用氣相色譜（GC）法或氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC -MS）法進(jìn)行檢測(cè)［7-10］。目前產(chǎn)品中的雜質(zhì)控制已成為影響質(zhì)量及優(yōu)化生產(chǎn)工藝的重要環(huán)節(jié)，樣品純度也成為產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。為此，本研究中采用液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（LC-IT-TOF/MS）法，直接分析堿破壞樣品中的降解產(chǎn)物，確立降解途徑，從而優(yōu)化合成工藝防止降解反應(yīng)發(fā)生，繼而提高產(chǎn)品質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀、UV-2450型紫外-可見分光光度儀，離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜液質(zhì)聯(lián)用儀（日本Shimadzu公司）。

1.2 試藥

檸檬酸三甲酯對(duì)照品（批號(hào)ZY160517，含量98%，上海譜振生物科技有限公司/上?？评噭┯邢薰荆?；檸檬酸三甲酯樣品（自制，批號(hào)為D0414）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Thermo Hypersil GOLD Dim 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（10∶90，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為20μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；接口電壓為4.5 kV；掃描范圍，一級(jí)質(zhì)譜m/z10～1 500，自動(dòng)多級(jí)m/z50～1 000；霧化氣為氮?dú)?，流速?.5 L/ min，漂移管溫度200 ℃；干燥氣為氮?dú)猓魉贋?0 L/ min；加熱模塊溫度為200 ℃；碰撞氣為氬氣；檢測(cè)器電壓為1.52 kV；校準(zhǔn)方法，自動(dòng)調(diào)諧優(yōu)化電壓，外標(biāo)法校準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)。

2.2 供試品溶液制備

取樣品2 份，各約50 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，均加入0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL 溶解，分別放置8，10 min，均加入0.1 mol/ L 鹽酸溶液中和，用流動(dòng)相定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，分別作為供試品溶液Ⅰ和Ⅱ。

2.3 分析方法選擇

取2.2 項(xiàng)下2 種供試品溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液Ⅰ中雜質(zhì)a的檢出量較小，檢出的雜質(zhì)主要為雜質(zhì)b，供試品溶液Ⅱ中雜質(zhì)a顯著增加，雜質(zhì)b降解（見圖1）。鑒于此，本研究中采用2 種降解模式富集雜質(zhì)、采集數(shù)據(jù)，采用LC-IT-TOF/MS技術(shù)對(duì)2種雜質(zhì)進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)解析。

圖1 高效液相色譜圖1.Impurity a 2.Impurity b 3.Trimethyl citrateA.Test solution Ⅰ B.Test solution ⅡFig.1 HPLC chromatograms

2.4 質(zhì)譜解析

2.4.1 檸檬酸三甲酯

檸檬酸三甲酯的相對(duì)分子質(zhì)量為234，其正離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖見圖2。其中未直接顯示分子離子峰，但在m/z235，252，257 處顯示M++1 峰、M++H2O 峰及M++Na峰。且由于檸檬酸三甲酯呈蠟狀，分子較黏稠，因此在m/z491 處出現(xiàn)較大量的2M++ Na 峰，表明所測(cè)分子結(jié)構(gòu)與檸檬酸三甲酯一致。

圖2 檸檬酸三甲酯正離子模式一級(jí)質(zhì)譜Fig.2 Primary mass spectrometry of trimethyl citrate in positive ion mode

2.4.2 雜質(zhì)b

正離子模式：一級(jí)質(zhì)譜圖見圖3 A，其中未顯示分子離子峰，在約m/z243，265，507處分別顯示M++Na峰、M++ CO2峰，以及二者結(jié)合后失去H+的結(jié)合峰，且由于分子的黏稠特性，在m/z991，870，749，628處分別出現(xiàn)了雙分子甚至四分子的結(jié)合峰，與其蠟狀性質(zhì)相一致。該M++CO2峰的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3 B。其中清楚顯示出其失去甲基（M+-15）在m/z205處的離子峰及其進(jìn)一步失去CO2Me后在m/z147處的離子峰。

圖3 雜質(zhì)b正離子模式質(zhì)譜A.Primarymassspectrometry B.SecondarymassspectrometryofM++CO2peakFig.3 Mass spectrometry of impurity b in positive ion mode

負(fù)離子模式：一級(jí)質(zhì)譜圖見圖4 A，在m/z219處清晰顯示了檸檬酸二甲酯的M-- 1 峰，與其含有羰基酸易失去質(zhì)子形成負(fù)離子的結(jié)構(gòu)一致。該峰的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖4 B。推測(cè)其最高峰（m/z143）為分子離子峰失去CO2Me 和水后的負(fù)離子峰。以上譜圖所示結(jié)構(gòu)與檸檬酸二甲酯一致。

圖4 雜質(zhì)b負(fù)離子模式質(zhì)譜A.Primary mass spectrometry B.Secondary mass spectrometry of M - - 1 peakFig.4 Mass spectrometry of impurity b in negative ion mode

2.4.3 雜質(zhì)a

正離子模式：一級(jí)質(zhì)譜圖見圖5 A。其中未直接顯示分子離子峰，但在m/z251 和273 處分別顯示M++CO2+1峰和M++CO2+Na峰，這與檸檬酸單甲酯易失去CO2的性質(zhì)一致。M++ CO2+ Na 峰的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖5 B。在m/z187處顯示分子離子失水再失去1個(gè)質(zhì)子的離子峰，在m/z147處則顯示失去CO2Me后的離子峰。

圖5 雜質(zhì)a正離子模式質(zhì)譜A.Primary mass spectrometry B.Secondary mass spectrometry of M+ +CO2 + Na peakFig.5 Mass spectrometry of impurity a in positive ion mode

負(fù)離子模式：一級(jí)質(zhì)譜圖見圖6 A，在m/z205處清晰顯示了M - - 1 的離子峰，與檸檬酸單甲酯含羧酸基團(tuán)易失去質(zhì)子形成負(fù)離子的性質(zhì)一致。該峰二級(jí)質(zhì)譜圖見圖6 B，在m/z173 處顯示其失去1 個(gè)分子甲醇后的離子峰，在m/z155 處則給出其進(jìn)一步失水的離子峰。以上譜圖所示結(jié)構(gòu)與檸檬酸單甲酯一致。

圖6 雜質(zhì)a負(fù)離子模式質(zhì)譜A.Primary mass spectrometry B.Secondary mass spectrometry of M - - 1 peakFig.6 Mass spectrometry of impurity a in negative ion mode

2.5 降解途徑

根據(jù)以上質(zhì)譜解析結(jié)果，初步分析得檸檬酸三甲酯堿降解途徑及降解產(chǎn)物，詳見圖7。

圖7 檸檬酸三甲酯堿降解途徑Fig.7 Alkaline degradation pathway of trimethyl citrate

3 討論

3.1 供試品溶液選擇

本研究中所用樣品以新合成路線研制，故通過解析主成分的質(zhì)譜以驗(yàn)證分子結(jié)構(gòu)。檸檬酸三甲酯為合成產(chǎn)品，雜質(zhì)含量很少，無法達(dá)到質(zhì)譜檢測(cè)所要求的檢出量，故在堿性條件下將酯水解成羧酸鈉鹽，結(jié)果堿降解8，10 min 時(shí)主要雜質(zhì)分別為檸檬酸二甲酯的同分異構(gòu)體及檸檬酸單甲酯的同分異構(gòu)體，繼而可通過有針對(duì)性地富集雜質(zhì)樣本，分階段對(duì)樣品進(jìn)行分析，以獲得高質(zhì)量質(zhì)譜圖，降低譜圖分析難度。

3.2 儀器與流動(dòng)相選擇

儀器中一旦存在不揮發(fā)鹽，便無法得到好的離子流，無論使用ESI還是大氣壓化學(xué)電離（APCI）均不能揮發(fā)，很可能堵住離子源后方的加熱毛細(xì)管，影響其他樣品分析。選擇液質(zhì)聯(lián)用儀，因其接口可避免不揮發(fā)的緩沖鹽進(jìn)入。儀器色譜條件中，常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈、水及其不同比例的混合物，以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液［11］。鑒于供試品溶液的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，故流動(dòng)相選用乙腈-水系統(tǒng)，響應(yīng)值更高。

3.3 質(zhì)量分析器選擇

液相色譜/質(zhì)譜常用的質(zhì)量分析器包括四極桿分析器、飛行時(shí)間分析器和離子阱飛行器。其中四極桿質(zhì)譜儀是最常見的質(zhì)譜儀器，定量能力突出，但無串極功能，定性能力不足；飛行時(shí)間質(zhì)譜儀質(zhì)量范圍寬，掃描速度快，但同樣無串極功能，限制了進(jìn)一步的定性能力；離子阱質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)小巧，質(zhì)量輕，靈敏度高，具有多級(jí)質(zhì)譜功能，但定量能力不足，無法做母離子掃描和中性丟失，在篩選特征結(jié)構(gòu)分子的時(shí)候能力不足。離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀實(shí)現(xiàn)了離子阱質(zhì)譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，既可用于制作多級(jí)質(zhì)譜，又能達(dá)到高質(zhì)量精度，具有高分辨率、高靈敏度的特點(diǎn)，提高了定性和定量能力。故本研究中選擇離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜。

3.4 方法評(píng)價(jià)

聯(lián)用分析技術(shù)是分析化學(xué)發(fā)展的重要發(fā)展方向之一。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜、質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)，近年來在生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、環(huán)境檢測(cè)、毒物分析等領(lǐng)域發(fā)揮了巨大作用［12-14］。本研究中所建立的LC-IT-TOF 法可用于檸檬酸三甲酯堿降解產(chǎn)物及降解途徑研究，進(jìn)而可為改進(jìn)檸檬酸三甲酯合成工藝及提高產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。