一測多評法檢測頭孢克洛膠囊中3 種已知雜質*

路愜楠，張素平，王 柳，張軼華

（河北省藥品醫療器械檢驗研究院·國家藥品監督管理局仿制藥質量控制與評價重點實驗室，河北 石家莊 050200）

頭孢克洛為第2代半合成頭孢菌素類抗菌藥物，其可抑制細菌細胞壁合成，臨床主要用于治療敏感菌所致呼吸系統、泌尿系統、耳鼻喉科、皮膚、軟組織等的感染。2020 年版《中國藥典（二部）》收載了頭孢克洛原料及制劑，在有關物質項下規定了頭孢克洛峰與頭孢克洛δ-3-異構體峰之間的分離度應不小于2.0，規定了單個雜質和雜質總和的限度，但未對各已知雜質進行控制。頭孢克洛原料及制劑的有關物質水合羥基化頭孢克洛［1］、頭孢克洛δ-3-異構體［2-4］均有系統報道，也有對頭孢克洛膠囊中12 種未知雜質的檢測［5］，但尚未見用一測多評法對3種已知雜質（頭孢克洛δ-3-異構體、水合羥基化頭孢克洛、雜質Ⅰ）進行定量控制的報道。高效液相色譜（HPLC）法是目前藥品有關物質檢查最常規的手段，但其常用的外標法常受雜質標準物質獲得困難等因素制約。一測多評法由于在日常檢驗中省去了雜質標準物質，又同時考慮了雜質與主成分的響應因子可能不同所引起的測定誤差，準確度較好［6-15］。本研究中探討了一測多評法用于控制頭孢克洛膠囊中3種已知雜質的可行性，為該制劑的質量控制提供了參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，包括紫外-可見分光檢測器（美國Waters公司）；MCM36型電子天平（德國Sartorius公司，精度為0.001 mg）。

1.2 試藥

頭孢克洛膠囊（某廠，批號分別為E382191102，E362191103，E392191104）；頭孢克洛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為130481 - 202007，含量84.1%）；頭孢克洛δ-3-異構體（歐洲藥典對照品，批號為C0640000，含量100%）；水合羥基化頭孢克洛對照品（批號為PITBK - 2- 20190112- 03，含量97.79%），雜質Ⅰ對照品（批號為PITBK-E-EP-YN0529-01，含量97.74%），均購自廣州牌牌生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動相：0.78%磷酸二氫鈉溶液（取磷酸二氫鈉7.8 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，用磷酸調pH 至4.0；A）-［0.78%磷酸二氫鈉溶液pH 4.0 - 乙腈（55∶45，V/V）；B］，梯度洗脫（0～30 min 時95%A →75%A，30～45 min時75%A →0 A，45～50 min時0 A，50～51 min時0 A →95%A，51～61 min時95%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；樣品放置溫度：4 ℃。

2.2 溶液制備

取頭孢克洛對照品適量，精密稱定，用0.27%磷酸二氫鈉溶液（pH 2.5，下同）溶解并制成成每1 mL 約含頭孢克洛10 μg 的對照品溶液。分別取頭孢克洛、頭孢克洛δ- 3 - 異構體、水合羥基化頭孢克洛和雜質Ⅰ對照品各適量，精密稱定，用0.27%磷酸二氫鈉溶液（pH 2.5）制成1 mg/ mL 的單一對照品貯備液；分別精密量取頭孢克洛對照品貯備液0.1 mL、頭孢克洛δ-3-異構體對照品貯備液0.25 mL、水合羥基化頭孢克洛對照品貯備液0.25 mL、雜質Ⅰ對照品貯備液0.15 mL，置10 mL 容量瓶中，用0.27%磷酸二氫鈉定容，搖勻，作為混合對照品溶液。取20粒樣品內容物，研細，取約相當于頭孢克洛（按C15H14ClN3O4S）0.5 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加0.27%磷酸二氫鈉溶液溶解并定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗

分離度考察：取混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，結果出峰順序依次為頭孢克洛δ-3-異構體、頭孢克洛、水合羥基化頭孢克洛和雜質Ⅰ，各峰間的分離度依次為10.9，6.3，5.1，均達到完全分離。詳見圖1。

圖1 分離度考察高效液相色譜圖1.Cefaclor δ - 3 - isomer 2.Cefaclor 3.Impurity Ⅰ 4.Hydrated hydroxylated cefaclorFig.1 HPLC chromatograms of resolution test

破壞性試驗：取供試品（批號為E382191102）適量，約相當于頭孢克洛0.5 g，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，分別按下述方法破壞。1）未破壞。加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）溶解并定容，搖勻，濾過，取續濾液。2）酸破壞。加入1 mol/L鹽酸1 mL，室溫放置1 h，加1 mol/L氫氧化鈉1 mL，加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）定容，搖勻，濾過，取續濾液。3）堿破壞。加入1 mol/L 氫氧化鈉1 mL，室溫放置1 h，加1 mol/L 鹽酸1 mL，加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）定容，搖勻，濾過，取續濾液。4）氧化破壞。加入30%過氧化氫溶液1 mL，室溫放置1 h，加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）定容，搖勻，濾過，取續濾液。5）內容物熱破壞。置80 ℃加熱1 h，取出放冷，加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）溶解并定容，搖勻，濾過，取續濾液。6）溶液熱破壞。加適量0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）溶解，置80 ℃加熱1 h，取出放冷，加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）稀釋并定容，搖勻，濾過，取續濾液。7）光破壞。取未破壞溶液適量，置5 000 lx 照度下光照24 h。取破壞后的溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果各降解雜質與主峰均分離良好。詳見圖2。

2.3.2 線性關系考察

精密量取頭孢克洛、頭孢克洛δ-3-異構體、水合羥基化頭孢克洛和雜質Ⅰ的對照品貯備液各適量，用0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）分別稀釋，制成系列對照品溶液，以質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。回歸方程及線性范圍見表1。

2.3.3 檢測限與定量限考察

分別精密量取2.3.2項下最低質量濃度溶液適量，倍比稀釋，并按2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比為10∶1、3∶1時的進樣量分別記作定量限、檢測限。詳見表1。

2.3.4 精密度試驗

取2.3.2 項下最低質量濃度溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，頭孢克洛、頭孢克洛δ-3-異構體、水合羥基化頭孢克洛和雜質Ⅰ峰面積的RSD分別為0.41%，0.18%，0.19%，0.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗

取混合對照品溶液適量，于5 ℃條件下放置0，6，12，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果頭孢克洛、頭孢克洛δ-3-異構體、水合羥基化頭孢克洛和雜質Ⅰ峰面積的RSD均小于2.0%，表明混合對照品溶液在5 ℃放置24 h 內基本穩定。取2.2 項下供試品溶液，在5 ℃條件下放置0，6，12，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果頭孢克洛、頭孢克洛δ-3-異構體、水合羥基化頭孢克洛、雜質Ⅰ在5 ℃放置6 h 內基本穩定，12 h 時雜質Ⅰ峰面積變大，24 h時雜質Ⅰ和水合羥基化頭孢克洛均已降解。

2.3.6 重復性試驗

稱取樣品適量，精密稱定，各6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，頭孢克洛、頭孢克洛δ-3-異構體、水合羥基化頭孢克洛、雜質Ⅰ含量的RSD分別為0.18%，0.18%，1.38%，1.32%（n= 6），表明方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收試驗

取已知含量的樣品（批號為E382191102）適量，共9份，分別加入低、中、高質量濃度的對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結果見表2。

表2 頭孢克洛已知雜質加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test of cefaclor and three known impurities（n = 9）

2.4 相對校正因子（RCF）及相對保留時間（RRT）

以2.3.2 項下各線性回歸方程中頭孢克洛的斜率除以已知雜質的斜率作為各成分的RCF。結果頭孢克洛δ-3-異構體、水合羥基化頭孢克洛、雜質Ⅰ的RCF分別為0.83，1.07，1.34，RRT分別為0.87，1.10，1.05。

2.5 耐用性試驗

精密量取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，考察不同液相色譜儀、品牌色譜柱、測定波長、柱溫、流動相pH、流速條件下的RCF 及RRT。結果表明，色譜條件發生一定變化時無顯著影響。詳見表3、表4（表中色譜柱規格均為250 mm×4.6 mm，5μm）。

表3 相對校正因子的耐受性考察結果Tab.3 Results of the durability test of relative correction factors

表4 相對保留時間的耐受性考察結果Tab.4 Results of the durability test of relative retention time

2.6 有關物質檢測

取3 批樣品各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，按加校正因子的主成分自身對照法計算各已知雜質含量，并與外標法計算結果比較。結果見表5，可見，2種方法對3種雜質含量的測定結果基本一致。

3 討論

由破壞試驗結果可見，頭孢克洛膠囊內容物加熱破壞對峰影響較小，而對溶液加熱破壞最敏感，產生較多雜質，在試驗中溶液應控制溫度，強酸、強堿和光破壞使頭孢克洛δ-3-異構體與水合羥基化頭孢克洛含量均增加，氧化破壞在11 min 左右會產生較大破壞產物。因此加強產品包裝的密閉性和遮光性十分必要。

本研究中考察了不同色譜條件對RRT 的影響，確定了各已知雜質相對主成分（頭孢克洛）的RRT，利用標準曲線法測定3種已知雜質的校正因子，將供試品溶液稀釋500倍作為自身對照，采用加校正因子的主成分自身對照法，計算3 種已知雜質的含量。所得結果與外標法所得結果無明顯差異，表明RCF 的計算結果準確。將測得的RRT 和RCF 載入質量標準，可供常規檢驗使用，能降低因主成分與雜質的絕對校正因子不同而引起的測定誤差，且無須長期使用雜質對照品，可替代外標法用于準確測定已知有關物質的含量。

綜上所述，本研究中所建立的方法操作簡單，結果準確，可用于頭孢克洛膠囊的雜質檢測。