萊菔硫烷干預晚期糖基化終末產物誘導血管平滑肌細胞轉分化研究*

李進冬，徐 震，張 楠，高 一，瞿建江，季曉慧△

（1. 南京醫科大學附屬泰州人民醫院，江蘇 泰州 225300； 2. 江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004； 3. 南京醫科大學附屬無錫人民醫院，江蘇 無錫 214023）

機體內氧化應激反應的失衡可損傷胰島細胞功能，同時降低外周組織對胰島素的敏感性，是導致糖尿病的重要因素［1］。氧化應激損傷可促進2 型糖尿病患者動樣硬化的發生，故成為動脈硬化干預的重要手段［2］。核因子E2 相關因子2（Nrf2）在氧化應激防御系統中發揮著重要作用。當機體在病理狀態下發生氧化應激反應時，細胞質中的Nrf2 會轉移至細胞核內，激活下游醌氧化還原酶1（NQO1）、血紅素加氧酶-1（HO-1）等基因的表達，從而增強機體的抗氧化應激能力，達到抗氧化的目的。研究表明，在多種因素刺激下，血管平滑肌細胞（VSMC）可由收縮表型轉化為合成表型，VSMC 向成骨細胞轉分化是一個主動、可逆轉、受高度調控且可預防的過程，在動脈硬化病變的發生、發展中起到重要作用［3］。晚期糖基化終末產物（AGE）可通過刺激VSMC 發生氧化應激反應，從而由收縮表型向成骨細胞轉分化，最終引起動脈硬化［4］。萊菔硫烷（SFN）屬異硫氰酸鹽類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、心血管保護等治療作用，在多種器官及組織中可激活Nrf2 相關信號通路，提高組織抗氧化應激能力，從而發揮保護作用［5］。本研究中以大鼠VSMC 為研究對象，探討了SFN 在AGE 誘導的VSMC 向成骨細胞轉分化中所起的作用及其機制，以期為臨床預防及治療糖尿病患者動脈硬化提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：DNM-9602型酶標儀（北京普朗新技術有限公司）；TG16W型微量高速離心機（德國Eppendorf公司）；GBOX -CHEMI-XX9-E 型高性能熒光、化學發光成像系統（基因有限公司）。

試藥：SFN（美國MedChemExpress公司，批號為HY-13755）；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（美國Bio-World 公司，批號為BS70000）；Runt 相關轉錄因子2（RUNX2）抗體（批號為WL03358）、骨橋蛋白（OPN）抗體（批號為WL00691），均購自沈陽萬類生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、鈣離子的檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為A003-1-2、A001-3-2、C004-2-1）；Nrf2 抗體（美國Proteintech 公司，批號為16396-1-AP）；NQO1抗體（批號為ab80588）、HO - 1 抗體（批號為ab189491），均購自英國Abcam 公司；RIPA 裂解液（批號為P0013B），苯甲基磺酰氟（PMSF，批號為ST506-2）、5×蛋白上樣緩沖液（批號為P0015），均購自上海碧云天生物技術有限公司；AGE（南京醫科大學附屬泰州人民醫院中心實驗室制備［6］）。

細胞：大鼠VSMC（上海中喬新舟生物科技有限公司，批號為ZQ0847）。

1.2 分組與處理

取細胞培養傳代至第5 代的VSMC 適量，按細胞密度每孔2 × 105個均勻接種于6 孔培養板中。實驗分為對照組［普通培養基培養2 d+ 含牛血清白蛋白（BSA）的培養基培養5 d］、AGE 組（普通培養基培養2 d + 含200 mg/L的AGE培養基培養5 d）、SFN組（含10μmol/L的SFN 培養基培養2 d + 含BSA 的培養基培養5 d）、SFN + AGE 組（含10 μmol/ L 的SFN 培養基培養2 d +含200 mg/L的AGE培養基培養5 d）。

1.3 評價指標

鈣離子、MDA 含量及SOD活性：取培養完成后各組細胞適量，按試劑盒說明書進行檢測。平行操作3次。

蛋白表達水平：采用Western blot法。取培養完成后各組細胞適量，加入細胞裂解液［RIPA - PMSF（100∶1，V/V）］，提取總蛋白，按4∶1比例加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃下加熱10 min。取適量蛋白進行SDS-PAGE，轉膜，以5%脫脂牛奶封閉，孵育α - SMA、RUNX2、OPN、Nrf2、NQO1、HO-1、GAPDH 及β-actin 的一抗孵育（均以1∶1 000 稀釋）過夜（4 ℃），洗脫，室溫孵育二抗1 h，顯影、定影。采取半定量分析法解讀結果，以內參GAPDH 及β - actin 信號強度為基準，校正檢測蛋白的相對表達量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 鈣離子、MDA 含量及SOD 活性

與對照組比較，AGE 組細胞內鈣離子、MDA 水平均顯著升高，SOD 水平顯著降低（P< 0.05）；與AGE 組比較，SFN + AGE 組細胞內鈣離子、MDA 水平均顯著降低，SOD水平顯著升高（P<0.05）。詳見表1。

表1 各組細胞內鈣離子、MDA及SOD水平比較（，n=3）Tab.1 Comparison of intracellular calcium ion，MDA and SOD levels in each group（，n = 3）

表1 各組細胞內鈣離子、MDA及SOD水平比較（，n=3）Tab.1 Comparison of intracellular calcium ion，MDA and SOD levels in each group（，n = 3）

注：與對照組比較，*P < 0.05；與AGE 組比較，#P < 0.05。圖1、圖2同。Note：Compared with those in the control group，*P < 0.05. Compared with those in the AGE group，#P < 0.05（for Tab.1 and Fig.1 - 2）.

SOD（U/mg）429.91±23.68 310.01±28.35*458.50±31.33 402.97±24.61#組別對照組AGE組SFN組SFN+AGE組鈣離子（mmol/L）1.23±0.05 2.52±0.19*1.21±0.04 1.71±0.15#MDA（nmol/mg）1.95±0.08 3.22±0.24*1.84±0.11 2.50±0.27#

2.2 OPN，RUNX2，α-SMA 蛋白表達水平

與對照組比較，AGE 組細胞內OPN 和RUNX2 蛋白表達水平均顯著升高，α-SMA蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；與AGE 組比較，SFN + AGE 組細胞內OPN和RUNX2 蛋白表達水平均顯著降低，α - SMA 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。詳見圖1。

圖1 細胞內OPN、RUNX2及α-SMA蛋白表達水平A.Electropherograms B.Data statistics（B1.OPN B2.RUNX2 B3.α - SMA）Fig.1 Expression levels of intracellular OPN，RUNX2 and α - SMA proteins

2.3 Nrf2，NQO1，HO-1 蛋白表達水平

與AGE 組比較，SFN + AGE 組細胞內Nrf2，NQO1，HO-1蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。詳見圖2。

圖2 細胞內Nrf2、NQO1及HO-1蛋白表達水平A.Electropherograms B.Data statistics（B1.Nrf2 B2.NQO1 B3.HO - 1）Fig.2 Expression levels of intracellular Nrf2，NQO1 and HO - 1 proteins

3 討論

動脈硬化是糖尿病的常見并發癥，其引起的心血管疾病可嚴重影響該類患者的長期生存率。研究表明，多種原因引起的氧化應激損傷在糖尿病患者動脈硬化形成中發揮著重要作用［7］。

VSMC 通常位于動脈中膜內，以收縮表型存在，主要作用為維持血管的彈性和收縮血管。在受到氧化應激損傷等刺激時，其由收縮表型向合成表型轉分化，從而促進動脈硬化的發生與發展。在這一過程中，細胞收縮表型標志物α - SMA、平滑肌- 22α 等丟失，而合成表型標志物OPN、RUNX2、堿性磷酸酶等增加［8］。糖尿病患者通常合并糖代謝異常。在糖尿病患者體內，AGE的表達量明顯增加，而AGE 可通過刺激細胞發生氧化應激損傷從而引起VSMC 轉分化［9］。本研究結果顯示，VSMC 經AGE 刺激后，細胞內鈣離子水平，成骨細胞標志物OPN，RUNX2 蛋白表達水平均顯著高于對照組，α-SMA 蛋白表達水平顯著低于對照組，細胞出現明顯轉分化現象。

Nrf2是機體調節抗氧化應激能力的重要轉錄因子，下游NQO1及HO-1是機體內重要的抗氧化酶，可維持細胞的穩定性，調節機體的抗氧化應激反應［10］。當機體遭受氧化應激損傷時，外源性刺激物可激活機體Nrf2基因，并進一步上調NQO1，HO-1基因的表達，從而提高機體的抗氧化應激能力以減輕損傷［11］。SFN 可激活多種組織內Nrf2基因的表達，從而減輕氧化應激引起的損傷，包括血管內皮細胞損傷［12］、肝臟缺血再灌注損傷［13］及心肌缺血再灌注損傷［14］等。本研究中發現，經AGE 刺激后VSMC 內氧化損傷顯著，表現為MDA 水平升高，SOD 水平下降。SFN +AGE 組細胞內鈣離子水平顯著降低，OPN、RUNX2 蛋白表達水平均顯著降低，α-SMA 蛋白表達水平顯著升高，表明SFN 能減輕AGE 誘導的細胞鈣化；且細胞內MDA 水平下降，SOD 水平升高，Nrf2，NQO1，HO-1蛋白表達水平均顯著升高，表明AGE 可能通過激活細胞氧化應激反應從而引起細胞鈣化，SFN 可提高細胞的抗氧化應激能力，從而減輕AGE引起的細胞鈣化，其機制可能與SFN 激活Nrf2 通路進而誘導抗氧化酶NQO1和HO-1的表達有關。

綜上所述，SFN 可增強細胞抗氧化應激能力，從而抑制AGE 誘導的VSMC 向成骨細胞轉分化，其機制可能與細胞內Nrf2 信號通路的激活有關。不足，本研究僅涉及細胞實驗，后續需在動物層面更進一步闡明SFN對糖尿病引發的動脈粥樣硬化的保護機制。