黃甲軟肝顆粒解酒護肝藥效學研究

張 云,茅向軍,張麗艷,于 婷,唐海姣,劉 洋,王宗權*,華 杰*

1.貴州中醫藥大學(貴州 貴陽 550025) 2.盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司(廣東 珠海 519031) 3.浙江維康藥業股份有限公司(浙江 麗水 323000)

急性肝損傷(acute liver injury)是常見的肝臟疾病,由多種致病因素引起,包括病毒感染,酒精攝入等導致氧化應激、炎癥反應和肝細胞凋亡等病理改變,長期的肝損傷會導致肝組織纖維化,還可能進一步引起肝硬化和肝癌的發生。因此預防和治療急性肝損傷具有重要的臨床意義[1]。

黃甲軟肝顆粒(huangjia ruangan granules)由黃芪、鱉甲、葛根、柴胡、靈芝、赤芍、丹參、三七、雞骨草和葉下珠10味藥組成。具有理氣疏肝、活血軟堅的功效,用于治療肝功能損傷及早期肝硬化[2]。有研究顯示[3]黃芪能顯著降低實驗性肝纖維化大鼠肝臟功能的結構損傷,對實驗性大鼠肝損傷具有保護作用。黃芪粗提物、黃芪總皂苷對CCl4引起的急性肝損傷小鼠具有顯著的保護作用[4]。鱉甲有效肽段能夠通過抑制促炎因子和EGFR,調節TIMPs/MMPs的平衡,進一步調控MAPK信號與TGF-β1/Smad信號發揮抗肝纖維化的療效[5]。同時葛根素也具有一定的治療急性肝損傷和抗肝纖維化作用,葛根素能夠緩解炎癥因子對肝組織造成的損傷,從而達到抗肝纖維化的作用[6-7]。小葉柴胡總黃酮對CCl4所致的小鼠急性肝損傷和北柴胡乙醇提取物對D-氨基半乳糖胺所致小鼠急性肝損傷具有顯著的保護作用[8-9]。丹參、三七、赤芍、雞骨草均對多因素引起的急性肝損傷小鼠具有很好的保護作用[10-14]。因此本研究通過建立小鼠急性肝損傷模型來觀察黃甲軟肝顆粒對肝的保護和預防作用,為后續臨床試驗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級昆明小鼠,體質量(18～22g),生產許可證號:SCXK(粵)2022-0002,使用許可證號:SYXK(粵)2020-0102,購自廣東省醫學實驗動物中心。

1.1.2 藥物與試劑 黃甲軟肝顆粒[盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司,批號:TC22001-1];總谷胱甘肽檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);丙二醛(MDA)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);乙醇脫氫酶(ADH)活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);HE染液(Servicebio公司)。

1.1.3 主要儀器 7890B氣相色譜儀美國安捷倫公司;Epoch2微孔板分光光度計,美國Biotek公司;Eclipse Ti-S顯微鏡,日本Nikon公司。

1.2實驗方法

1.2.1 黃甲軟肝顆粒對小鼠醉酒的解酒作用 昆明小鼠60只,雄性,按體質量隨機分為6組,每組10只,分別為:正常組,模型組,黃甲軟肝顆粒低劑量組(2g/kg),黃甲軟肝顆粒中劑量組(4g/kg),黃甲軟肝顆粒中劑量組(8g/kg),谷胱甘肽組(246mg/kg)。按設計劑量灌胃給藥,正常組和模型組給予20mL/kg蒸餾水,1次/d,連續7d。末次給藥前各組小鼠禁食12h,末次給藥60min后,除正常組外的各組按14mL/kg灌胃給予60°紅星二鍋頭白酒,1h后摘眼球取血。血液中乙醇濃度檢測:摘眼球取血約0.8mL,EDTA或肝素抗凝全血-20℃保存1周內進行檢測。其中取0.1mL血樣于頂空進樣瓶中,加入100μL正丁醇(濃度為4μg/mL)作內標,加蓋密封后采用頂空瓶氣相色譜法(GC)測定血液中乙醇濃度。肝臟組織的谷胱甘肽、MDA含量及ADH活力檢測:動物取血后脫頸椎處死,取肝臟100mg于-80℃保存,制成肝勻漿后,測定谷胱甘肽、MDA、ADH活力。

1.2.2 黃甲軟肝顆粒對CCl4誘導的急性肝損傷的保護作用 昆明小鼠60只,雄性,分別按體質量隨機分為6組,每組10只,分別為:正常組,模型組,黃甲軟肝顆粒低劑量組(2g/kg),黃甲軟肝顆粒中劑量組(4g/kg),黃甲軟肝顆粒高劑量組(8g/kg),谷胱甘肽組(246mg/kg)。連續給藥14d,動物末次給藥后禁食16h,模型組及各給藥組灌胃0.5% CCl4植物油溶液5mL/kg,正常組灌胃植物油5mL/kg,24h后,摘眼球取血及分離保存肝臟組織用于指標檢測和組織病理學檢查。

1.3觀察指標血清指標檢測:小鼠取血分離血清,用全自動血生化儀測定血清中的谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)。肝臟組織抗氧化指標檢測:取肝臟左葉同一部位,生理鹽水洗凈、濾紙吸干后稱重,置于EP管中剪碎,按試劑盒說明書制備肝組織勻漿并測定丙二醛(MDA)和總谷胱甘肽。肝組織病理學檢查:取小鼠肝右葉用4%多聚甲醛固定24h,從中部做橫切面取材,乙醇脫水,石蠟包埋常規病理制片石蠟包埋,5μm切片,蘇木精伊紅染色,顯微鏡下觀察組織學變化。切片觀察肝細胞壞死、脂肪變性和胞漿疏松、水腫的程度。

1.4統計學處理實驗數據由GraphPad Prism 9生物統計學軟件進行統計學處理:計量資料以Mean±SD表示,采用方差分析結合Dunnett’s多重比較法進行分析,肝臟病理學評分采用Kruskal-Wallis秩和檢驗結合Dunnett’s多重比較法進行分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1黃甲軟肝顆粒對醉酒小鼠的解酒作用

2.1.1 對急性酒精性肝損傷小鼠血液中乙醇濃度的影響 與正常組比較。模型組血液中酒精含量顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,黃甲軟肝顆粒高劑量組和谷胱甘肽組小鼠血液中乙醇濃度顯著降低(P<0.05),見圖1。

與模型組比較,*:P<0.05;與正常組比較,**:P<0.01。

2.1.2 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織的谷胱甘肽含量的影響 與正常組比較,模型組肝臟組織的谷胱甘肽含量顯著降低(P<0.01),與模型組比較,黃甲軟肝顆粒高劑量組的谷胱甘肽含量有增加的趨勢(P>0.05),谷胱甘肽組的谷胱甘肽含量顯著增加(P<0.05),見圖2。

與模型組比較,*:P<0.05;與正常組比較,**:P<0.01。

2.1.3 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織MDA含量的影響 與正常組比較,模型組肝臟組織MDA含量顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,黃甲軟肝顆粒中劑量組和谷胱甘肽組肝臟組織MDA含量顯著降低(P<0.05),見圖3。

與模型組比較,*:P<0.05;與正常組比較,**:P<0.01。

2.1.4 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織ADH活性的影響 與正常組比較,模型組肝臟組織ADH活性顯著降低(P<0.01),與模型組比較,黃甲軟肝顆粒高劑量組ADH活性顯著增加(P<0.05),谷胱甘肽組ADH活性顯著增加(P<0.05),見表1。

表1 黃甲軟肝顆粒對小鼠肝臟組織ADH活力的影響

2.2黃甲軟肝顆粒對小鼠急性肝損傷模型的作用

2.2.1 對CCl4急性肝損傷血清肝功能指標影響 與正常組比較,模型組小鼠血清ALT、AST活性顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,黃甲軟肝顆粒中劑量組小鼠血清ALT活性顯著降低(P<0.05);AST活性顯著降低(P<0.05);谷胱甘肽組血清ALT、AST活性均顯著降低(P<0.05或P<0.01),見表2。

表2 對急性肝損傷小鼠肝功能指標的影響

2.2.2 對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟組織中MDA含量的影響 與正常組比較,模型組肝臟組織MDA含量顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,黃甲軟肝顆粒中劑量組和谷胱甘肽組肝臟組織MDA含量顯著降低(P<0.05),見圖4。

與模型組比較,*:P<0.05;與正常組比較,**:P<0.01。

2.2.3 對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟組織中谷胱甘肽含量的影響 與正常組比較,模型組肝臟組織的谷胱甘肽含量顯著降低(P<0.01),谷胱甘肽組的谷胱甘肽含量顯著增加(P<0.05),見圖5。

與模型組比較,*:P<0.05;與正常組比較,**:P<0.01。

2.2.4 對CCl4急性肝損傷肝臟病理組織學的影響 肝組織HE染色光鏡下觀察如圖6所示:正常組肝細胞排列整齊、結構清晰、脂肪含量較少;模型組肝細胞排列紊亂結構疏松,細胞體積明顯增大,部分細胞的胞漿、胞核消失。與模型組比較,黃甲軟肝顆粒中、高劑量組和谷胱甘肽組小鼠肝細胞結構有一定改善,細胞漿和細胞核溶解程度有所減輕。

A.正常組,B.模型組,C.黃甲軟肝顆粒低劑量組,D.黃甲軟肝顆粒中劑量組,E.黃甲軟肝顆粒高劑量組,F.谷胱甘肽組。

3 討論

本實驗采用60°白酒進行造模,以谷胱甘肽作為陽性對照藥物,研究黃甲軟肝顆粒對小鼠醉酒的解酒作用。黃甲軟肝顆粒和谷胱甘肽片對小鼠血液中乙醇濃度顯著降低(P<0.01)。說明黃甲軟肝顆粒對小鼠肝組織的酒精起到一定的分解轉化作用,有效降低組織中乙醇等相關物質的含量,并且與谷胱甘肽有相同的治療效果;黃甲軟肝顆粒的谷胱甘肽含量有增加的趨勢,說明黃甲軟肝顆?？捎行г黾有∈蟾谓M織谷胱甘肽的含量,通過促進肝臟的修復功能,并且對CCl4急性肝損傷小鼠肝組織中谷胱甘肽的含量有增加的趨勢,通過與肝組織中的氧化物質反應,以達到減輕酒精性肝損傷的目的。

實驗中黃甲軟肝顆粒通過加速MDA的分解轉化,使小鼠肝組織含量始終保持一個較低的水平,能有效降低肝損傷的風險。說明在該實驗條件下,黃甲軟肝顆粒對CCl4急性肝損傷小鼠肝組織中MDA的含量有明顯的降低趨勢,對降低小鼠肝組織MDA含量與谷胱甘肽片有相同的治療效果;與正常組比較,模型組肝臟組織ADH活性顯著降低(P<0.01),與模型組比較,黃甲軟肝顆粒ADH活性顯著增加(P<0.01),通過激活肝組織中ADH的活性,ADH催化乙醇脫氫反應生成乙醛,乙醛在體內經ALDH繼續催化氧化反應,生成乙酸,繼而合成乙酰輔酶A進入三羧酸循環,最終分解成CO2和H2O排出體外。

本實驗通過黃甲軟肝顆粒對CCl4誘發的小鼠急性肝損傷模型的治療作用,研究黃甲軟肝顆粒對肝組織細胞的改善作用。正常人血清中ALT和AST正常值<40U/L,當肝細胞受到損傷時,細胞膜電位受到破壞,ALT和AST進入血液,導致其在血清中水平升高,其水平越高肝損傷越嚴重。與模型組比較,黃甲軟肝顆粒對小鼠血清ALT活性有顯著降低的趨勢;AST活性顯著降低(P<0.05);且與谷胱甘肽對小鼠血清ALT、AST活性降低有相類似的功效。

通過HE染色液對正常組、模型組、給藥組和谷胱甘肽組肝細胞病理切片在光學顯微鏡下觀察,結果顯示正常組肝細胞排列整齊、結構清晰、脂肪含量較少;模型組肝細胞排列紊亂結構疏松,細胞體積明顯增大,部分細胞的胞漿、胞核消失。與模型組比較,黃甲軟肝顆粒中、高劑量組和谷胱甘肽組小鼠肝細胞結構有一定改善,細胞漿和細胞核溶解程度有所減輕。

綜上所述,黃甲軟肝顆粒對小鼠醉酒有較好的解酒作用;能降低急性酒精性肝損傷小鼠血液中乙醇濃度水平,減輕肝組織氧化損傷;能降低CCl4急性肝損傷小鼠的肝功能損傷和氧化損傷,改善肝組織細胞病變,表明黃甲軟肝顆粒具有較好的解酒護肝作用。