線粒體DNA D-Loop區突變與弱精癥的相關性

陳孟權，單婷婷，黃蕊，孔萬仲

1.溫州市中醫院 檢驗科，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫藥大學 醫學技術與信息工程學院，浙江 杭州 310053

據世界衛生組織（World Health Organization,WHO）和中華醫學會男性不育癥診療指南規定，夫婦雙方未采用任何避孕措施同居生活1年以上，其中男方因素導致女方不孕者，稱為男性不育癥。近年來由于環境污染嚴重、生活壓力大、飲食習慣不良和生活習慣變化等多因素共同作用，因不孕不育就診的患者逐年增加，據WHO統計，全球有10%～15%的育齡夫婦存在不孕不育問題，甚至一些發展中國家的某些地區可高達30%，其中男性因素導致不育的占50%[1-3]。男性不育癥患者較為常見的臨床表現主要是弱精癥，即經精液常規檢查主要表現為精子前向運動百分率＜32%或精子總活力＜40%[4]。

線粒體作為精子細胞中唯一的細胞器，在氧化磷酸化、細胞生長、信息傳遞和遺傳等生理過程中均發揮重要的作用，其主要分布在精子尾部中段，為精子運動和功能提供能量保障。線粒體DNA（mtDNA） 作為線粒體的獨立遺傳物質，存在于線粒體內膜和基質內，是一條全長為16 569 bp的環狀閉合雙鏈DNA分子，負責編碼37個基因，包括22個tRNA基因、2個rRNA基因（16S rRNA和12S rRNA）以及13個組成呼吸鏈復合體部分亞基的多肽基因[5-7]。mtDNA由于缺乏組蛋白保護及完整有效的DNA修復系統，容易受到活性氧（reactive oxygen species, ROS）及其他自由基的損傷，導致其突變率相比核基因組高出10～100倍[8-11]。

D-Loop區是mtDNA的非編碼區域，包含了mtDNA輕重鏈轉錄啟動子和重鏈復制起始點，在mtDNA復制和轉錄過程中發揮重要的調控作用[12]。D-Loop區中存在高突變區域（hypervariable region）[13]，其高頻率的突變可能引起mtDNA的復制和轉錄功能出現異常，造成mtDNA數量減少、呼吸鏈相關蛋白和ATP合成不足以及線粒體功能障礙等，使得精子獲能不足、動力下降等，最終將導致弱精癥[14]。本研究將通過對弱精癥患者精子mtDNA的D-Loop區基因進行測序，分析其基因變異類型和變異頻率的差異，探討精子mtDNA D-Loop區基因突變和弱精癥的相關性及其臨床應用價值。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2019年7月至2021年3月溫州市中醫院診治的男性不育癥患者134例，年齡23～42歲，平均年齡33歲，有1年以上不育史，精液常規分析提示精子前向運動率＜32%，符合第五版《WHO人類精液檢驗與處理實驗室手冊》中弱精癥的相關診斷標準，且其配偶的婦產科相關檢查均正常。同時選取129例因女性不孕就診的健康男性精液作為對照組，年齡22～40歲，平均年齡32歲，精液常規等檢查結果均正常。

全部研究對象留取樣本時均符合以下標準：①禁欲時間為2～7 d；②無泌尿系統感染史、附睪炎病史、睪丸損傷史、精索靜脈曲張治療史及相關性腺器官發育異常史；③常規精液檢測相關參數均齊全；④符合本研究相關入組標準。本研究經溫州市中醫院倫理委員會批準（WTCM-KT-2021045），所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 精液基因組DNA提取：精液樣本經離心后收集精子細胞層，采用基因組DNA提取試劑盒[購于天根生化科技（北京）有限公司]提取精子總DNA，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 引物合成及PCR擴增：根據已報道的mtDNA D-Loop區引物序列[12]，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，見表1。按要求配置20 μL的PCR反應體系，反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃再延伸7 min；4 ℃保存，產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外凝膠成像系統（Tanon）確 認。

表1 mtDNA D-Loop區擴增引物設計

1.2.3 PCR產物測序及分析：將PCR產物送尚亞生物技術有限公司進行測序，所有樣本采用雙向重復測序，保證測序的準確性。以劍橋標準序列（rCRS）為參照，對測序結果進行分析，查找突變位點。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS21.0軟件對實驗數據進行統計學分析。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組精子細胞mtDNA D-Loop區突變情況 通過對弱精癥組（n=134）和對照組（n=129）的D-Loop區進行測序，共發現247種突變，其中弱精癥組患者精子細胞中發現178種，對照組精子細胞中發現182 種，兩組顯示出相近的單核苷酸多態性（SNP） （2 232/134=16.66，2 259/129=17.51）。有62種突變的發生率＞5%，其中大多在HV-1區（55.31%）和HV-2區（32.47%）。D-Loop區域的4個新突變均為核苷酸缺失突變，見圖1、表2。

圖1 4種新突變的測序結果比對圖

表2 4個D-Loop區域的新突變位點[例（%）]

2.2 兩組精子細胞mtDNA D-Loop區突變的差異性分析 對發生率＞5%的62種突變的分析顯示，突變以替換突變為主（87.03%），其中替換突變54個，缺失突變5個，插入突變3個，且替換突變數量與其他兩種突變的差異具有統計學意義（P＜0.01）；替換突變大多為T＞C（42.2%）、A＞G（23.03%）以及C＞T（22.78%）等，且不同替換類型在兩組間的分布差異無統計學意義（P=0.389），見圖2。本研究發現有11種突變在兩組間差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

圖2 兩組間不同類型替換突變的差異

表3 兩組精子細胞mtDNA D-Loop區突變分析[例（%）]

2.3 弱精癥患者精子活動力水平與mtDNA D-Loop區突變的關系 根據精子細胞前向運動百分率將弱精癥患者分為輕度68例（20%～32%）、中度48例（10%～20%）及重度18 例（＜10%），其中mtDNA DLoop區基因突變發生率＞5%的有92種，分析發現有4種突變在不同嚴重程度的弱精癥患者間差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 不同嚴重程度弱精癥患者精子細胞mtDNA D-Loop區突變分析[例（%）]

3 討論

臨床上男性不育大多表現為弱精癥，即精子前向運動力減弱，從而引起不孕不育。作為細胞“動力工廠”的線粒體，是精子細胞的重要能量來源，若線粒體功能發生障礙，將影響精子細胞正常的生命活動和運動能力[15]。mtDNA由于其特殊的結構特點而具有較高的突變率[16]，尤其作為mtDNA復制和轉錄調控區的D-Loop區，不僅包含了H鏈、L鏈轉錄啟動子和H鏈復制起始點，還存在兩個極具不穩定性的高突變區域（HV-1、HV-2），這些區域的高頻突變可能導致復制和轉錄等功能紊亂[16-19]。

本研究結果顯示所有研究對象在D-Loop區均有不同程度的突變，發生率＞5%的突變有62 種，其中位于HV-1區（55.31%）的突變明顯多于HV-2區（32.47%），替換突變數量（87.03%）明顯高于其他突變類型，替換突變中以T＞C占比最大（42.2%），其次為A＞G（23.03%）和C＞T（22.78%），同時我們還發現了4個未見報道過的新突變。

此前，已有多位學者發現mtDNA D-Loop區在各類腫瘤、慢性肝腎疾病、類風濕關節炎等疾病中表現出高突變率。SULTANA等[20]提出D-Loop區突變可能抑制電子傳遞鏈的進行，造成高水平ROS釋放堆積，是腫瘤的誘發劑及啟動劑。DRAGONI等[21]發現腦部病變時D-Loop區的甲基化水平明顯增高。ALTAFI等[22]通過比較腦腫瘤組織及其相鄰組織的mtDNA序列，發現兩者D-Loop區突變存在明顯差異。WANG等[23]研究發現mtDNA D-Loop區突變與胃腸道腫瘤進展存在相關性。位于D310區的微衛星序列，表現為多聚C單核苷酸重復序列，目前已被證實與乳腺癌有關[24-25]。研究[26-29]顯示mtDNA D-Loop區突變與類風濕性關節炎發病年齡、慢性腎功能衰竭、潰瘍性結腸炎以及喉癌之間均存在相關性。這些研究表明，D-Loop區突變的積累可能導致呼吸鏈環節發生異常，ROS大量堆積，進而造成細胞損傷和疾病發生[12]。

有不少研究報道弱精癥患者存在mtDNA拷貝數異常[30-32]和大片段缺失現象[33-34]，本課題組前期研究[35]提示弱精癥組mtDNA拷貝數降低，但未發現大片段缺失，而D-Loop區與mtDNA復制轉錄過程息息相關，在弱精癥相關研究中卻較少被提及，在弱精癥發生發展過程中的表現和作用亦不明確。本研究通過分析發現，有11種突變在弱精癥患者和對照組之間存在顯著性差異，其中T16172C、CAA16179C、C16257A、C16261T、T16304C可能會增加弱精癥風險，而CA16179C、A16182C、A16183C、A16230G、T16249C、G16319A則相反。此前有報道T16172C和A16183C在子宮內膜異位癥中亦呈現相同的表現[36]， T16304C與卵巢癌發病年齡有關[37]，C16179T與精子活力和濃度下降顯著相關[38]，本研究中CAA16179C、CA16179C、A16182C和A16183C在弱精癥患者中均有顯著差異，可能與緊鄰16184-16193的微衛星結構（C5TC4）有關，這些突變可能造成該微衛星結構的多胞嘧啶單核苷酸重復模式改變，增加其不穩定性。C16257A和C16261T作為弱精癥的風險因素，同時也被報道參與組成漢族人群II型糖尿病和中重癥新冠肺炎的風險因素（G5417A/C16257A/C16261T），參與ROS堆積和線粒體破壞[39-40]。此外，本研究通過比較發現4種突變在不同程度弱精癥之間存在顯著性差異，其中T16140C、C16291T可能是弱精癥患者精子活力進一步下降的風險因素，T16092C和T16311C則可能是弱精癥患者病情進展的保護性因素，需要進一步研究明確其相關性。

綜上所述，本研究結果表明，弱精癥患者精子細胞mtDNA D-Loop區存在顯著差異，可能在弱精癥發生發展中發揮重要作用，對弱精癥的臨床診療具有一定提示意義，同時也為線粒體DNA點突變在弱精癥機制研究方面提供新的思路和證據。