MiR-152-3p靶向調控KLF4促進結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲

趙建國，朱曉靈，金學英，江黎明，李振軍，陳遐林

紹興市人民醫院 浙江大學紹興醫院，浙江 紹興 312000，1.腫瘤內科；2.肛腸外科

結腸癌（colon cancer, CC）是常見的胃腸道惡性腫瘤，是癌癥相關死亡的第二大原因[1]。據統計，CC的發病率和病死率自2000 年以來總體呈下降趨勢，但在50歲以下的年輕人群中卻持續上升[2]。因此，CC依然是嚴重威脅人類身體健康的惡性腫瘤之一，需要進一步探究其分子機制，制定具有針對性的診斷和治療策略。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一類小的內源性單鏈非編碼RNA，可以通過調控相應mRNA靶標的表達，進而調節眾多生物過程，在不同類型腫瘤的發生發展過程中往往都伴隨著miRNA的表達異常[3-4]。 miR-152-3p作為一個重要的miRNA，在多種癌細胞的發展過程中起到關鍵作用，如肝細胞癌[5]、非小細胞腺癌[6]、前列腺癌[7]等。在肺癌中，miR-152-3p作為lncRNA KIF9-AS1的下游靶標，可抑制肺癌細胞對順鉑的敏感性[8]。在甲狀腺乳頭狀癌中，miR-152-3p低表達可促進甲狀腺乳頭狀癌細胞惡性進展，且miR-152-3p通過靶向TGFA發揮作用[9]。此外，有研究報道miR-152-3p在CC中的表達異常[10-11]。但有關miR-152-3p在CC中是促癌因子還是抑癌因子的結論卻不完全一致。Krüppel樣因子4（Krüppellike factor 4, KLF4）是一種鋅指轉錄因子，在多種癌癥中差異表達[12-13]。KLF4同樣在不同癌種中發揮促癌或抑癌作用[14-15]。在CC中，KLF4對CC細胞耐藥性產生影響[16]。但miR-152-3p對CC細胞表型的影響是否與KLF4有關，還需進一步探究。因此，進一步研究miR-152-3p在CC中的分子機制，明確其在CC中的作用，具有一定意義。

本研究通過調控miR-152-3p及其靶基因在CC細胞中的表達，進一步探究miR-152-3p對調控CC細胞的增殖、遷移和侵襲過程的分子機制，明確其在CC細胞中的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑 人正常結腸上皮細胞 CCD841CON（BNCC338086）、人CC細胞系HCT116（BNCC287750）、SW620（BNCC337664）、SW480（BNCC100604）均購自北京北納生物科技有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、鏈霉素、青霉素、Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、結晶紫均購自美國Thermo Fisher公司，EMEM培養基、RPMI-1640培養基、DMEM培養基、L-15 培養基購自美國Gibco公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green?Premix Ex TaqTM均購自日本TaKaRa公司，RIPA裂解液、ECL試劑盒、MTT溶液均購自中國Solarbio公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國Beyotime公司，PVDF膜和EZ Magna RIP Kit購自美國Millipore公司，一抗兔抗KLF4（ab215036）、兔抗GAPDH（ab181602）、二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab6721）均購自英國Abcam公司，pmirGLO、Luciferase Assay System均購自美國Promega公司，Transwell小室購自美國Corning公司，細胞周期試劑盒、細胞凋亡試劑盒均購自南京凱基生物有限公司，ABI 7500 Real-Time PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，熒光及化學發光成像系統購自中國Clinx公司，流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司。

1.2 生物信息學分析 從TCGA數據庫中下載CC表達量數據集，采用“edgeR”包對數據集進行差異分析（|logFC|＞2，adj.p value＜0.01）。利用starBase 數據庫預測has-miR-152-3p靶基因以及結合位點，結合相關性分析，初步確定其靶向結合關系及表達情況。

1.3 細胞培養 CCD841CON細胞在含10% FBS、 0.1 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的EMEM培養基中培養；HCT116細胞在含10% FBS、0.1 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養基中培養；SW620細胞在含10% FBS、0.1 mg/mL鏈霉素和100 U/mL 青霉素的DMEM培養基中培養；SW480 細胞在含10% FBS、0.1 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的L-15培養基中培養。培養條件均為37 ℃，5% CO2。

1.4 載體構建和細胞轉染 mimic NC、miR-152-3p mimic購自美國Thermo Fisher公司，pcDNA3.1-KLF4質粒（oe-KLF4）和空pcDNA3.1質粒（oe-NC）由上海生工生物工程有限公司合成。將CC細胞接種到6孔板中（1×105個/孔）培養。待細胞匯合度至80%左右時，按制造商的說明書，使用Lipofectamine 2000將mimic NC、miR-152-3p mimic、oe-NC和oe-KLF4轉染至CC細胞中，并在合適的培養基中培養，培養條件：37 ℃，5% CO2。

1.5 RT-qPCR 使用TRIzol試劑從結腸癌細胞中提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser將RNA反轉錄為cDNA。接著使用TB Green?Premix Ex TaqTM在ABI 7500 RT-PCR系統上進行RT-qPCR檢測。miR-152-3p以U6為內參，KLF4以GAPDH為內參，引物序列見表1。用2-ΔΔCt法比較相對表達量的差異。

表1 引物列表

1.6 Western blot 用RIPA裂解液從細胞中提取總蛋白，隨后用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白進行定量。經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，再將蛋白轉移至PVDF膜上。將PVDF膜于5%脫脂牛奶中封閉1 h，隨后將膜分別與一抗兔抗KLF4（1:1 000）、一抗兔抗GAPDH（1:10 000）在4 ℃下孵育過夜。TBST清洗3次后，與辣根過氧化物酶標記的二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（1:2 000）在室溫下孵育2 h。使用ECL試劑盒在熒光及化學發光成像系統檢測蛋白條帶并拍照。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測 將細胞接種到24孔板中，構建含有WT-KLF4（野生型）和MUT-KLF4（突變型）兩種pmirGLO熒光素酶質粒。隨后將mimic NC和miR-152-3p mimic與WT/MUT-KLF4 質粒共轉染到細胞中。轉染48 h后，根據廠商說明書使用 Luciferase Assay System測定熒光素酶活性。

1.8 RNA結合蛋白免疫沉淀實驗 使用EZ Magna RIP Kit，根據制造商的說明書進行RIP實驗。將SW480細胞接種到培養皿中，使用RIP裂解緩沖液裂解細胞，并加入anti-KLF4抗體或正常兔IgG免疫沉淀RNA-蛋白復合物，在4 ℃孵育6 h后，純化共沉淀的RNA，并進行RT-qPCR分析。

1.9 MTT實驗 收集對數期CC細胞，接種于96 孔板（3×103個/孔），在37 ℃、5% CO2條件下培養。在培養24、48、72、96 h時，小心吸去上清，加入 90 μL新鮮培養液，再加入10 μL MTT溶液，繼續培養4 h。隨后吸掉上清，每孔加入100 μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在570 nm處測量各孔的吸光值。

1.10 劃痕愈合實驗 將轉染后的CC細胞接種在6孔板中（2×105個/孔）培養，當細胞匯合度達80%左右時，用200 μL移液管尖端輕輕刮擦經過孔中心垂直于孔板路徑上的細胞，PBS洗滌除去分離的細胞，加入無血清培養基，在0 h和24 h時分別在顯微鏡下拍照記錄。

1.11 Transwell侵襲實驗 將用無血清培養基重懸的CC細胞加入到用基質膠包被的Transwell小室上室中，在下室添加含10% FBS的DMEM培養基。在37 ℃和5% CO2條件下培養24 h。除去底部膜表面的細胞后，4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色，顯微鏡下觀察，拍照。

1.12 流式細胞術檢測細胞周期 收集轉染48 h后的CC細胞，按照細胞周期試劑盒說明書，制備單細胞懸液，加入預冷的70%乙醇固定，4 ℃下過夜。PBS洗去固定液，1 000 r/min離心3 min，收集沉淀細胞。加入提前配制好的500 μL PI/RNase A染色工作液，室溫避光30 min后，使用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.13 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集轉染48 h后的CC細胞，按照細胞凋亡試劑盒說明書，用胰蛋白酶（不含EDTA）消化細胞，然后收集并重懸于PBS （4 ℃）中。1 000 r/min離心細胞并去除PBS后，加入Binding Buffer輕輕吹勻制備單細胞懸液。加入5 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）混勻后，加入5 μL PI。室溫下避光10 min，隨后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.14 統計學處理方法 每次實驗進行3次技術性重復，采用GraphPad Prism 8.0軟件對數據進行分析。正態分布計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Students’t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-152-3p在CC中表達上調促進細胞惡性行為 從TCGA數據庫中下載表達量數據集的數據[正常組織（n=8），腫瘤組織（n=457）]。對數據進行差異分析，相對于正常組織，miR-152-3p在腫瘤組織中顯著上調（P＜0.001），見圖1A。qRT-PCR檢測miR-152-3p在人正常結腸上皮細胞CCD841CON和人CC細胞HCT116、SW620、SW480中的表達情況，結果表明人CC細胞中miR-152-3p的相對表達量均顯著高于人正常結腸上皮細胞（P＜0.01），見圖1B。選取相對表達較高的SW480細胞與mimic NC和miR-152-3p mimic進行轉染。RT-qPCR檢測轉染后的兩組SW480細胞miR-152-3p相對表達量，結果顯示轉染miR-152-3p mimic后的細胞miR-152-3p表達量顯著增高（P＜0.01），見圖1C，證明轉染效率較好，可用于后續實驗。MTT實驗結果顯示，過表達miR-152-3p的SW480細胞增殖能力顯著高于正常表達的細胞（P＜0.01），見圖1D。細胞劃痕愈合實驗結果顯示，過表達miR-152-3p后細胞遷移能力較正常表達miR-152-3p的細胞顯著增高（P＜0.001），見圖1E。Transwell實驗結果顯示，過表達miR-152-3p的細胞侵襲能力顯著增高（P＜0.01），見圖1F。細胞周期實驗結果顯示，miR-152-3p過表達使G0/G1期細胞所占比例顯著降低（P＜0.01），見圖1G。細胞凋亡實驗結果顯示，過表達miR-152-3p使SW480細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），見圖1H。

圖1 miR-152-3p在CC細胞中高表達且促進細胞惡性行為

2.2 miR-152-3p和KLF4 存在靶向結合關系 從TCGA數據庫下載表達量數據集的數據[n（正常組織）=41，n（腫瘤組織）=480]，分析得KLF4在腫瘤組織中顯著下調（P＜0.01），見圖2A。相關性分析結果顯示KLF4與miR-152-3p呈現顯著負相關（P＜0.01），見圖2B。RT-qPCR和Western blot檢測KLF4的mRNA和蛋白在人正常結腸上皮細胞CCD841CON和人CC細胞HCT116、SW620、SW480中的表達情況，結果顯示，人CC細胞中KLF4的mRNA和蛋白相對表達量均顯著低于人正常結腸上皮細胞（均P＜0.01），見圖2C。通過starBase數據庫預測得miR-152-3p與KLF4存在結合位點（圖2D）。為驗證miR-152-3p和KLF4之間的關系，進行雙熒光素酶報告基因檢測和RIP實驗。雙熒光素酶實驗結果顯示過表達miR-152-3p顯著降低了人CC細胞中野生型KLF4 報告基因的熒光活性 （P＜0.01），而對突變型KLF4報告基因的熒光活性沒有影響（P＞0.05），見圖2E，表明miR-152-3p和KLF4之間存在靶向關系。RIP實驗表明，與IgG組相比，在anti-KLF4免疫沉淀中，miR-152-3p的表達量顯著增加（P＜0.01），見圖2F，表明miR-152-3p可能直接與KLF4相互作用。隨后，RT-qPCR和Western blot實驗檢測轉染了mimic NC和miR-152-3p mimic的SW480細胞中KLF4的表達水平。結果顯示，過表達miR-152-3p使細胞中KLF4的mRNA和蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01），見圖2G，表明miR-152-3p與KLF4呈負相關性，與生物信息學分析的結果一致。

圖2 miR-152-3p靶向下調KLF4的表達

2.3 KLF4在CC中抑制細胞惡性行為 選取相對表達量變化較大的SW480細胞與oe-NC和oe-KLF4進行轉染。RT-qPCR和Western blot檢測轉染后的兩組細胞KLF4的mRNA和蛋白相對表達量，結果顯示轉染了oe-KLF4的細胞KLF4的mRNA和蛋白表達量均顯著增高（P＜0.01），見圖3A，轉染效率較好。MTT實驗結果顯示，相較于較正常表達的細胞，過表達KLF4的細胞增殖能力顯著降低（P＜0.01），見圖3B；劃痕愈合實驗結果顯示，過表達KLF4的細胞遷移能力顯著降低（P＜0.01），見圖3C；同樣地，Transwell實驗結果顯示，過表達KLF4的細胞侵襲能力受到顯著抑制（P＜0.01），見圖3D。細胞周期實驗結果顯示，過表達KLF4使SW480細胞中G0/G1期細胞所占比例顯著升高（P＜0.05），見圖3E。細胞凋亡實驗結果顯示，過表達KLF4的細胞凋亡率顯著上升（P＜0.01），見圖3F。

圖3 KLF4抑制CC細胞的惡性行為

2.4 miR-152-3p通過負調控KLF4 促進CC細胞增殖、遷移和侵襲 構建以下分組：mimic NC+oe-NC、miR-152-3p mimic+oe-NC、mimic NC+oe-KLF4、miR-152-3p mimic+oe-KLF4。qRT-PCR和Western blot結果顯示，相較于正常表達組，單獨過表達miR-152-3p的細胞KLF4的mRNA和蛋白相對表達量均顯著降低（P＜0.01），而單獨過表達KLF4后KLF4的mRNA和蛋白的相對表達量顯著增高（P＜0.01），同時過表達miR-152-3p和KLF4后，細胞中KLF4的表達情況得到恢復（圖4A）。MTT實驗中，單獨過表達miR-152-3p的細胞增殖能力顯著增高（P＜0.01），而單獨過表達KLF4的細胞增殖能力顯著降低（P＜0.01），兩者同時過表達使增殖能力變化得到恢復（圖4B）。劃痕愈合和Transwell實驗結果顯示，單獨過表達miR-152-3p后細胞的遷移能力和侵襲能力均顯著增高（均P＜0.01），而單獨過表達KLF4的細胞遷移能力和侵襲能力均顯著降低（均P＜0.01），而同時過表達miR-152-3p和KLF4則使細胞的遷移和侵襲能力恢復到正常表達組的水平（圖4C、圖4D）。細胞周期和細胞凋亡實驗中，單獨過表達miR-152-3p的細胞處于G0/G1期的顯著減少（P＜0.01），且細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）；單獨過表達KLF4的細胞顯著滯留于G0/G1期（P＜0.01），細胞凋亡率也顯著增高 （P＜0.01）；而兩者同時過表達后則抑制了這些變化（圖4E、圖4F）。

圖4 miR-152-3p通過靶向KLF4影響CC細胞的發生發展過程

3 討論

越來越多的研究證明，miRNA在腫瘤發生發展過程中發揮關鍵作用。一些miRNA在多種腫瘤中表達異常，因此其可能被用于預測腫瘤患者的預后。有多個研究報道miR-152-3p在CC中表達異常[10-11，21]， 但結果卻不全一致。基于此，我們通過生物信息分析初步確定miR-152-3p在CC組織中的表達上調，隨后在CC細胞系中進行實驗檢測驗證了miR-152-3p的表達，miR-152-3p過表達促進CC細胞增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，并增加G2/M細胞比例。這表明，本研究中miR-152-3p在CC中發揮促癌作用。

目前對于miR-152-3p的研究報道顯示，其可以通過作用于多個靶基因發揮腫瘤調控作用，如 SLC7A5[22]、RAB14[23]和ITGA9[24]等。本研究中，我們通過生物信息分析預測到miR-152-3p與KLF4具有結合位點，并利用雙熒光素酶和RIP實驗驗證了兩者的靶向結合關系。接著我們對miR-152-3p和KLF4進行相關性預測分析，并通過qRT-PCR和Western blot實驗驗證了miR-152-3p與KLF4 呈負相關性。KLF4是一個鋅指轉錄因子，通過上調p21WAF1/Cip1和下調cyclin D1來抑制結直腸癌細胞的增殖，在結直腸癌中確認為抑制腫瘤的基因[25]。本研究中KLF4過表達可抑制CC細胞增殖、遷移和侵襲，促進凋亡，并阻滯細胞周期在G0/G1期。在miR-152-3p過 表達的同時上調KLF4的表達，則可以減弱miR-152-3p過表達對CC細胞表型的促進作用。這表明在CC中，miR-152-3p通過靶向KLF4調控細胞表型。有研究發現，KLF4與干細胞分化有關[26]。MA等[14]研究發現KLF4與整合素β4結合后，通過維持癌癥干細胞形狀對神經膠質瘤發揮促進作用。此外，有研究報道，KLF4對上皮向間充質轉化（epithelial mesenchymal transformation, EMT）誘導轉錄因子發揮抑制作用，進而對EMT的發生產生影響[27]。因而，我們猜測在CC中，miR-152-3p靶向KLF4對CC細胞增殖、遷移和侵襲等產生影響，其中KLF4 可能通過影響多種途徑，比如細胞干性、EMT進程等對CC細胞發揮作用。當然，這還需要在未來的研究中繼續探究。

綜上所述，本研究明確了miR-152-3p在CC中為促癌因子，并參與調節腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究尚存不足之處，今后還需利用動物實驗進行進一步驗證，并納入臨床樣本進行檢測，使其能真正應用于臨床。