歐蒙免疫印跡法（ANA 譜3）模條本底顏色變深對結(jié)果影響2 例分析

章曉霞，李發(fā)爵，李湘成，陳民，蘇悅，付紅，彭麗平，梁小燕

（1.景德鎮(zhèn)市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 景德鎮(zhèn) 333000；2.南昌美康盛德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司，江西 南昌 330000；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310000）

歐蒙印跡法中所包被的抗原均為生化特性明確的純化抗原，因此具有良好的檢測敏感性[1]。 操作過程中，模條本底顏色變深、掃描不報(bào)警的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生；但本底顏色很深及掃描報(bào)警，顯示“不可用的”情況也偶有發(fā)生，表明實(shí)驗(yàn)失敗，復(fù)查也如此，報(bào)告發(fā)不出。 2020 年12 月18 日和2021 年1 月1 日2 名住院患者ANA 譜3 模條 （15 項(xiàng)）顏色很深及掃描報(bào)警，顯示“不可用的”；經(jīng)進(jìn)一步分析為球蛋白增多，增加了模條的吸附所至。 血清經(jīng)適當(dāng)稀釋，減少球蛋白的含量，從而減少吸附達(dá)到可以掃描，不報(bào)警，實(shí)驗(yàn)成功的目的；再加做間接免疫熒光 （IIF：HEp-2 細(xì)胞），ANA 譜3 報(bào)告就可以安心發(fā)出。 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2 病例均來自撫州市第一人民醫(yī)院住院病人，其中病例1，游某，男，51 歲，臨床診斷：肺部感染、乙型肝炎后肝硬化失代償期、低蛋白血癥、胸腔積液、脾大。 病例2，羅某，女，47 歲，臨床診斷：腎病綜合癥、狼瘡性腎炎、甲減、高血壓病等。

1.2 檢測方法 ANA 譜3 采用歐蒙免疫印跡法，在全自動(dòng)EUROBlotMadter Ⅱ儀、 佳能CanoScan LiDE120 掃描儀及配套試劑上進(jìn)行；IIF 采用歐蒙試劑及EUROStar ⅢPlus 熒光顯微鏡上進(jìn)行。 結(jié)果見表1、圖1~圖8。

表1 2 病例實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

圖1 第2 條模條為病例1 ANA 譜3 模條圖形，本底顏色很深，未見質(zhì)控帶

2 討論

病例1，ANA 譜3 模條本底顏色很深，未見質(zhì)控帶，掃描報(bào)警，提示“不可用的”，見圖1、圖2；說明實(shí)驗(yàn)失敗，復(fù)查也如此，經(jīng)與歐蒙工程師溝通，告知給病人退費(fèi)。 筆者通過1:3 稀釋血清，模條顯示較清晰質(zhì)控帶，經(jīng)掃描后質(zhì)控帶顯示1 個(gè)“+”，未出現(xiàn)報(bào)警（正常質(zhì)控帶顯示黑色+～+++為合格），結(jié)果為ANA 譜3 所有項(xiàng)目陰性，見圖3、圖4。 再經(jīng)IIF 的驗(yàn)證：S＜1:100（參考值：＜1:100）、核型：陰性，見表1。最終報(bào)告該病人ANA 譜3 所有項(xiàng)目為陰性。

圖2 病例1 模條經(jīng)掃描后（黃色區(qū)域）圖形，提示“不可用的”

圖3 黃線上模條為病例1 血清經(jīng)1:3 稀釋后的ANA 譜3 模條圖形，見較清晰質(zhì)控帶

圖4 病例1 血清經(jīng)1:3 稀釋后的ANA 譜3 模條的掃描圖形（黃線上），未見報(bào)警，質(zhì)控帶顯示1 個(gè)“+”。結(jié)果為全陰性

病例2，ANA 譜3 模條本底顏色較深，見模糊質(zhì)控帶，掃描報(bào)警，提示“不可用的”，見圖5、圖6，說明實(shí)驗(yàn)失敗。 通過1:2 稀釋血清，模條顯示較清晰質(zhì)控帶，經(jīng)掃描后質(zhì)控帶顯示“++”，未出現(xiàn)報(bào)警，結(jié)果為抗SSA、Ro-52、ds-DNA、ANuA、Histone抗體分別為1 個(gè)“+”，見圖7、圖8。 因血清1:2 稀釋，所以該病人ANA 譜3 上述5 項(xiàng)抗體分別報(bào)告2 個(gè)“+”是較準(zhǔn)確的。 IIF 結(jié)果S=1: 640、核型為均質(zhì)；其它（ds-DNA（ELISA）633.34 IU/mL、熒光強(qiáng)陽性，也可說明這一點(diǎn)，見表1。

圖5 第2 條模條為病例2 ANA 譜3 模條圖形，本底顏色較深，見模糊質(zhì)控帶

圖6 為病例2 模條經(jīng)掃描后（黃色區(qū)域）圖形，提示“不可用的”

圖7 第2 條為病例2 血清經(jīng)1:2 稀釋后的ANA 譜3 模條圖形，見較清晰質(zhì)控帶

圖8 第2 條為病例2 血清經(jīng)1:2 稀釋后的ANA 譜3 模條的掃描圖形，未見報(bào)警，質(zhì)控帶顯示“++”。結(jié)果為抗SSA、Ro-52、ds-DNA、ANuA、Histone 抗體分別為1 個(gè)“+”

對于某些患者的特殊情況（例如臨床用藥、肝功能異常等）導(dǎo)致血清樣本中非特異蛋白質(zhì)、膽紅素或血脂等含量增加， 上述物質(zhì)可能會(huì)被吸附到膜片上，最終導(dǎo)致非特異性背景顏色的增強(qiáng)[1]。 病例1 乙型肝炎后肝硬化失代償，腎功能輕度異常，肝纖4 項(xiàng)升高，除輕度黃疸（TBil21.7 umol/L）外、血脂偏低，球蛋白升高明顯（64.3 g/L）；病例2 腎病綜合癥、狼瘡性腎炎，膽紅素、血脂正常，IgG 達(dá)到2 580 mg/dL（參考值：751~1 560 mg/dL），TP63.6g/L、ALB26 g/L、GLB37.6 g/L，也就是球蛋白升高。 所以筆者認(rèn)為模條顏色變深可能主要與病人球蛋白升高相關(guān)，球蛋白越高模條顏色越深，甚至導(dǎo)致掃描不成功，顯示“不可用的”，實(shí)驗(yàn)失敗。 通過對血清的適當(dāng)稀釋，減少球蛋白的含量，從而降低模條的吸附及本底顏色，以達(dá)到可以掃描，不報(bào)警，實(shí)驗(yàn)成功的目的。 掃描結(jié)果×稀釋倍數(shù)即為最終報(bào)告結(jié)果；加做IIF 報(bào)告可進(jìn)一步增加可信度，因?yàn)镠Ep-2 細(xì)胞中包含100~150 種自身抗原，美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）已將間接免疫熒光檢測推薦為檢測ANA的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]，中國免疫學(xué)會(huì)臨床免疫分會(huì)、歐洲自身免疫標(biāo)準(zhǔn)化促進(jìn)會(huì)（EASI） 將其推薦為ANA檢測的“參考方法”[3-5]。 值得注意的是，熒光顯微鏡的質(zhì)量和熒光光源強(qiáng)度及濾光器的配置要好，否則會(huì)影響結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性[6]。

有些研究中，在深色背景下，只要能觀察到特異性抗原位置條帶陽性，均可視為明確陽性；若背景顏色過深而嚴(yán)重影響到結(jié)果判讀， 則樣本不適用于該檢測體系，可考慮采用其他的檢測方法（如ELISA）進(jìn)行檢測。 但本研究中血清稀釋法再加上IIF 作為補(bǔ)充也不失為一種簡便易行的方法。 由于觀察樣本例數(shù)有限， 在今后的工作中增加觀察例數(shù)及與臨床的結(jié)合， 以對此類問題有一個(gè)比較全面的了解。