鼻咽原發腫瘤微環境中免疫反應對鼻咽癌預后的影響

邵靜，魏鑫鑫，范栩嫚

（南陽市中心醫院耳鼻喉科，河南 南陽 473000）

鼻咽癌作為常發于鼻咽腔側壁或者頂端的惡性腫瘤， 常發于我國南方地區， 具有一定的地域性。 鼻咽癌發病較為隱匿，易發生轉移[1-2]。 腫瘤微環境一方面為腫瘤的發生、 發展等過程提供了條件， 另一方面腫瘤微環境也是機體免疫系統與腫瘤進行博弈的場所[3]。 腫瘤微環境免疫反應不僅能起到抑癌作用，還能起到促癌的作用，故腫瘤微環境中的免疫反應在腫瘤的發展進程中發揮著重要作用[4]。T 細胞是淋巴細胞中數量較多、功能較為復雜的一類細胞，其中CD4+與CD8+是成熟T 細胞亞群的主要標志[5]。FOXP3 分子是作用于調節性T 細胞（Treg）進行細胞免疫的重要分子并且其具有特異性高等特點，具有作為分子標志物的優勢[6]，而TGF-β1 作為腫瘤分泌的炎性細胞因子，具有調節T 細胞作用，對腫瘤的發生、發展具有一定的抑制作用[7]。 目前研究表明原發腫瘤體積、發生遠處轉移、某些蛋白的表達（如LINC00161）是影響鼻咽癌預后的因素[8-9]，但是關于鼻咽原發腫瘤微環境中免疫反應對鼻咽癌預后的影響尚未見文獻報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014 年6 月至2017 年6 月南陽市中心醫院收治的鼻咽癌患者50 例。 納入標準：（1）患者組織病理學檢測證實為鼻咽癌；（2）符合鼻咽癌診斷標準[10]；（3）術前未接受過放化療、分子靶向治療等抗腫瘤治療；（4） 臨床病理資料完整；（5）患者及其家屬同意參與本研究，并簽署知情同意書。 排除標準：（1） 患有嚴重免疫疾病者；（2）伴有其他惡性腫瘤者；（3）患有嚴重心腎疾病者。 納入患者男性30 例，女性20 例；年齡25～72歲，平均年齡（55.92±4.21）歲；腫瘤TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期39 例， Ⅲ～Ⅳ期11 例； 發生淋巴結轉移23例，未發生轉移27 例；腫瘤分期T1+T2 30 例，T3+T4 20 例。 本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有患者均知情同意。本研究隨訪截止時間：2020 年6 月30 日。

1.2 免疫組化方法 利用免疫組化雙染色法對分子標志物FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 進行檢測。將制備好的組織切片于56 °C 烘干30～60 min，按照常規方法進行脫蠟及脫水。 利用雙內源酶阻消除內源性過氧化物酶的活性。 按照1:10 000 的比例滴加一抗，4 °C 孵育過夜。 清洗3 次， 1：5 000的比例滴加二抗，37 °C 條件下孵育30 min， PBS清洗3 次， 每次10 min， 1:50 的比例滴加DAB 顯色劑顯色， 8 min，蒸餾水沖洗終止顯色反應。 蘇木素復染15～30 min，流水沖洗，于含1%鹽酸的酒精中進行分化2 s，利用蒸餾水沖洗，切片再次返藍。之后利用80%、95%及100%的乙醇對切片梯度脫水， 65 °C 恒溫箱干燥，二甲苯透明處理后，中性樹膠封片。

1.3 觀察指標 采用雙盲的方式對免疫組化結果進行判定， 選取對患者病情不知情的3 位病理學醫生對結果進行判定。3 位醫生判定結果一致納入結果， 不一致則邀請其他病理學醫生進行再一次判定。FOXP3 陽性信號定位于淋巴細胞核中，CD4+/CD8+陽性信號定位于淋巴細胞胞膜上，TGF-β1定位于淋巴細胞胞漿中。 首先在×100 低倍鏡下選取腫瘤淋巴細胞最豐富的區域， 在×400 高倍視野下隨機選取3 個不重復且具有代表性的視野，統計每個視野下陽性細胞的個數， 取其平均值即為高倍鏡視野陽性細胞百分率[11]。 計算Cut-off值將分子標志物FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 分別分為高表達、低表達。

1.4 統計學方法 所有研究數據均在SPSS 19.0 軟件上運行處理，治療前后計量資料用（±s）表示，符合正態分布的數據組間比較采用t檢驗，不符合正態分布數據比較采用Mann-Whitney秩和檢驗；計數資料用百分數 （%） 表示， 組間比較采用χ2與Fisher確切概率法（n<5）檢驗。Cut-off值采用最小P值法計算，患者生存率采用Kaplan-Meier法進行估計，影響預后的因素采用Cox比例風險模型，檢驗標準設置為P<0.05。

2 結果

2.1 FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 在鼻咽原發腫瘤組織中的表達情況 在鼻咽原發腫瘤組織中FOXP3 在淋巴細胞核中表達，CD4+/CD8+在淋巴細胞胞膜上表達， TGF-β1 在淋巴細胞胞漿中表達，見圖1。

圖1 FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 在鼻咽原發腫瘤組織中的表達情況

2.2 單因素Cox生存分析 單因素Cox生存分析發現， 間質與癌巢中FOXP3、CD4+/CD8+、、TGF-β1等免疫細胞浸潤較多的患者較數量少的患者發生轉移與死亡的風險較低（P<0.05），見表1。

表1 總生存與無瘤生存單因素Cox 生存分析

2.3 FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 數量對鼻咽癌患者預后的影響 以患者ROC曲線建立的Cut-off值作為臨界值， 將FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 分為高、低表達組，Cut-off值為3.0，Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank統計結果表明，FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 細胞與鼻咽癌患者無瘤生存時間及總體生存時間呈現正相關， 表達量高者患者預后較好， 差異有統計學意義 （χ2=7.031，P=0.000，χ2=7.324，P=0.000），見圖2。

圖2 微環境中免疫反應與患者的Kaplan-Meier 累計生存曲線

2.4 FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 與各項臨床參數之間的相關性 結果詳見表2。

表2 FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1與各項臨床參數之間的相關性

3 討論

鼻咽癌是遭受EB 病毒感染后發生的一種惡性腫瘤， 鼻咽原發腫瘤組織局部存在大量的淋巴細胞，并且還存在其他的免疫浸潤[12]。 由于鼻咽癌發病較為隱匿，早期缺乏相應的檢測方法，缺少有效的輔助治療手段， 易導致鼻咽癌患者較早的發生復發與轉移[13]。 免疫微環境作為腫瘤的“第七大標記性特征”，是腫瘤微環境有機整體的重要組成部分[14]。某些免疫細胞浸潤在腫瘤微環境中會對整個腫瘤微環境的免疫應答產生影響， 從而影響腫瘤的發生發展[15]。

CD4+T 細胞可以通過分泌不同的細胞因子，進而對免疫系統進行調節， 而CD8+T 細胞浸潤則對患者預后具有積極作用， 能夠通過釋放穿孔素等因子來殺死腫瘤細胞[16-17]。FOXP3 是一種編碼位于X 染色體上的， 該分子是調節Treg 免疫抑制功能的主要分子， 是一種具有特異性的較為可靠的分子標志物[18]。 TGF-β1 作為腫瘤分泌的炎性細胞因子，其能夠誘導CD4+Treg 細胞的擴增，同時其還能將非調節性CD4+T 細胞轉化為CD4+Treg，在一定程度上起到抗腫瘤的作用[19]。本研究結果表明，間質與癌巢中FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 等免疫細胞浸潤較多的患者較數量少的患者發生轉移與死亡的風險較低且患者預后較好， 提示FOXP3、CD4+/CD8+及TGF-β1 在鼻咽癌患者免疫反應中起著抗腫瘤的作用，并且能夠改善患者預后，減少復發、轉移等風險的產生。 Treg 作為腫瘤免疫逃逸的重要機制之一， 其能夠通過抑制效應細胞的免疫反應來抑制機體的抗腫瘤免疫應答[20]。Treg 細胞在鼻咽原發腫瘤微環境中表達量明顯升高， 陽性細胞中FOXP3、CD4+/CD8+數量明顯上升， 在微環境中被誘導分化后，發揮抗腫瘤作用[21]。有研究表明，在胰腺癌等腫瘤細胞中， 大量的Treg 能夠在胰腺導管組織中大量聚集，被腫瘤微環境招募，進而發揮抗腫瘤作用， 影響患者預后[22]。 TGF-β1 是由Treg 細胞分泌的免疫抑制因子， 其能夠與白細胞介素等細胞因子共同發揮作用阻礙樹突狀細胞的分化以及抗原的提呈等作用， 影響細胞免疫在抗腫瘤過程中的作用，影響T 細胞亞群的分化，在免疫反應過程中發揮作用，影響患者的預后[23]。 結腸癌研究中發現TGF-β1 能夠起到免疫抑制的作用[24]。 本研究結果表明，FOXP3、CD4+/CD8+、TGFβ1 表達與患者TNM 分期、發生淋巴結轉移及腫瘤分期相關。 鼻咽原發腫瘤惡化程度越高，其轉移趨勢逐漸變強， 鼻咽原發腫瘤微環境中免疫反應FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 等可以通過調控淋巴管中的調控因子的表達，抑制淋巴管的生成，阻止鼻咽癌的淋巴結轉移，發揮抗腫瘤的免疫反應，是影響預后的良好指標[20]。

綜上所述， 鼻咽原發腫瘤微環境中免疫反應能夠促進機體的免疫應答，抑制腫瘤的發生、發展等過程，影響患者的預后。