多囊卵巢綜合征患者顆粒細胞miR-3135b 的表達及臨床意義

許珂，畢曉英，趙艷曉，王丹丹

（河南中醫藥大學第三附屬醫院生殖中心，河南 鄭州 450000）

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovarian syndrome,PCOS） 是一種以排卵障礙和高雄激素血癥為特征的女性生殖內分泌及代謝異常疾病[1]，患者可出現卵巢增大、白膜增厚、多個不同發育階段的卵泡，并伴有顆粒細胞黃素化[2]。 PCOS 的確切發病機制尚未明確， 目前普遍認為其臨床表現及生化特征的復雜性和多樣性， 與卵巢顆粒細胞增殖引起的內在異常密切相關[3-4]。 微小核糖核酸（microRNAs,miRNAs） 是一類在物種進化中相對保守的單鏈非編碼小分子RNA， 其組織特異性和時序性可決定組織和細胞的功能特異性， 在細胞生長和發育過程的調節中具有重要作用[5]。 既往研究顯示，PCOS患者體內miRNAs 的異常表達與顆粒細胞（Granulosa cells, GCs）生長、增殖和分化有關，miRNAs 表達涉及生理和病理變化， 可作為監測疾病進展的理想標志[6]。 本研究主要探討分析PCOS 患者顆粒細胞miR-3135b 的表達及臨床意義，旨在為PCOS發病機制的研究提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年1 月至2021 年1 月河南中醫藥大學第三附屬醫院收治的92 例因PCOS 導致不孕患者納入PCOS 組，年齡25~45 歲，平均（31.29±2.41）歲，平均體質量指數（Body mass index,BMI）為（23.95±2.13） kg/m2。 納入標準：（1）年齡＞18 歲；（2）符合PCOS 診斷標準[7]（符合以下三項中兩項即可確診：①稀發排卵或無排卵；②出現多毛、痤瘡等高雄激素臨床表現；③B 超檢查結果顯示卵巢出現多囊樣改變）（3）近3 個月內未接受激素治療者。 排除標準：（1）合并嚴重心、肝、腎等臟器功能不全及其他免疫性相關性疾病者；（2）合并高血壓、糖尿病者；（3）合并凝血功能障礙、甲狀腺功能亢進者；（4） 入組前3 個月內有手術史者；（5）合并子宮內膜異位癥、輸卵管積水者；（6）既往有異常流產史或胎兒發育異常史者；（7）合并惡性腫瘤或心理、精神疾病者。 選取92 例同期于本院因輸卵管或男方不育等原因導致不孕患者納入對照組，年齡26~45 歲，平均（31.75±2.26）歲，平均BMI 為（23.69±2.07） kg/m2，兩組患者年齡、BMI 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經倫理委員會通過。

1.2 檢測方法

1.2.1 儀器與試劑 主要儀器實時定量PCR 儀(CFX96 型，美國Bio-Rad 公司)，電泳儀(CPC-300型，上海百賽生物技術股份有限公司)，凝膠成像分析系統(BIO-RAD 型， 上海艾研生物科技有限公司)，分光光度計（NANO Drop 2000）；主要試劑：TRIzol Reagent 試劑盒(上海雙達生物技術有限公司)，反轉錄試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)，實時PCR 試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)，DNA Marker (上海韻泰信息科技有限公司)，RNA Marker(北京澤平科技有限責任公司)。

1.2.2 GCs 收集[8]于患者排卵日，在超聲引導下經陰道穿刺抽吸卵泡，選取直徑≥16 mm。操作步驟：（1）用針分離單個卵母細胞周圍的GCs，取出卵丘卵母復合體，并收集剩余的卵泡液；（2）卵泡液離心后，棄上清，剩余沉淀物加透明質酸鈉1 mL 充分混勻，水浴后移至無菌離心管，加入4 mL 淋巴細胞分離液后離心；（3） 取離心后GCs 至離心管內，接種于全營養培養基，置于37 ℃5%CO2 培養箱中培養24 h；（4） 將培養的GCs 細胞收集后于-80 ℃保存備用。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應法 （Real-Time quantitative polymerase chain reaction, qRTPCR） 檢測miR-3135b 的表達 采用Trizol 試劑抽提GCs 中總RNA， 使用分光光度計于260 nm 和280 nm 波長下測定所有樣品中A260 /A280，并計算所有RNA 的濃度和純度。 采用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA，反應產物稀釋后作為qRTPCR 模板。 使用實時熒光定量PCR 儀檢測PCOS患者GCs 中miR-3135b 的表達，反應條件如下: 95℃預變熱10 min、95 ℃15 s、55℃20 s、70 ℃20 s，如此循環40 次。以U6 為內參，引物序列見表1。用2－△△CT方法計算miR-3135b 的相對表達量，對比兩組患者顆粒細胞miR-3135b 的表達。 文中所用引物序列均由華大基因設計。 所有步驟均嚴格按照各儀器及試劑說明書進行。

表1 引物序列

1.3 觀察指標 記錄兩組患者年齡、 不孕年限、BMI、空腹血糖（Fasting blood glucose, FBG）、LH、FSH、LH/FSH、E2、 T、P、 FINS、FBG、PRL 及初始卵泡、閉鎖卵泡、竇卵泡、過渡型初級卵泡、典型初級卵泡、次級卵泡、獲卵數和胚胎形成率。 采用穩態評估模型評價計算HOMA-IR，計算公式為HOMAIR=(FINS×FBG)/405。 胰 島 素 抵 抗 評 定 標 準：HOMA-IR＞3.8。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0 統計學軟件進行數據分析， 滿足正態分布且方差齊的計量資料采用（±s）表示，采用兩樣本獨立t檢驗比較組間差異，用ROC分析miR-3135b 表達對PCOS 的診斷價值，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料和臨床特征比較 兩組患者年齡、不孕年限、BMI 和FBG 比較，差異無統計學意義 （P＞0.05）；PCOS 組患者LH、LH/FSH、P、T、FINS、HOMA-IR 和E2 均明顯高于對照組，FSH、PRL 則低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者一般資料和臨床特征比較（±s）

表2 兩組患者一般資料和臨床特征比較（±s）

指標 PCOS 組（n=92） 對照組（n=92） t P年齡（歲）不孕年限（年）BMI（kg/m2）FBG（mmol/L）FINS（pmol/L）HOMA-IR LH（U/L）FSH（U/L）LH/FSH PRL（nmol/L）P（nmol/L）T（nmol/L）E2（pmol/L）30.21±2.37 3.01±0.95 25.07±3.24 5.04±0.41 19.14±10.29 2.98±1.52 8.15±3.74 7.28±2.43 1.32±1.01 0.77±0.45 1.46±0.94 1.54±0.49 166.05±68.13 30.36±2.52 3.03±0.78 24.98±3.35 4.91±0.57 15.68±10.54 2.45±1.17 4.96±2.62 8.05±2.56 0.72±0.34 0.92±0.37 1.03±1.08 0.95±0.33 145.28±64.89 0.416 0.156 0.185 1.776 2.253 2.650 6.701 2.092 5.400 2.469 2.880 9.579 2.117 0.678 0.876 0.853 0.077 0.026 0.009＜0.001 0.038＜0.001 0.014 0.004＜0.001 0.036

2.2 兩組患者卵巢各級卵泡數及獲卵數、胚胎成型率比較 兩組患者初始卵泡、閉鎖卵泡數和胚胎形成率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；PCOS 組過渡型初級卵泡、典型初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡數和獲卵數明顯高于對照組， 差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表3。

表3 兩組患者卵巢各級卵泡數及獲卵數、胚胎成型率比較（±s）

表3 兩組患者卵巢各級卵泡數及獲卵數、胚胎成型率比較（±s）

指標 PCOS 組（n=92） 對照組（n=92） t P初始卵泡過渡型初級卵泡典型初級卵泡次級卵泡竇卵泡數閉鎖卵泡數獲卵數胚胎形成率20.51±7.26 10.23±2.81 5.42±2.65 1.72±1.03 34.14±11.32 3.28±2.65 16.29±5.32 0.47±0.25 19.24±5.12 6.78±2.60 2.01±0.73 1.06±0.68 17.68±5.65 2.79±1.42 13.34±4.98 0.46±0.18 1.371 8.644 11.899 5.129 12.479 1.563 3.883 0.311 0.172＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.119＜0.001 0.756

2.3 GCs 中miR-3135b 的表達 采用qRT-PCR 檢測GCs 中miR-3135b 的表達水平， 結果顯示，PCOS 組中miR-3135b 表達量（1.92±1.08）顯著高于對照組 （1.02±0.33）， 差異有統計學意義 （P＜0.05）。

2.4 miR-3135b 表達對PCOS 的診斷價值 根據2.3 結果，為測試miR-3135b 表達對PCOS 的診斷能力，建立了ROC曲線，結果顯示，miR-3135b 表達診斷PCOS 的AUC為0.750， 截斷值為1.55，敏感度為58.7%，特異度為95.7%（P＜0.001）。見圖1。

圖1 miR-3135b 表達診斷PCOS 的ROC 曲線

3 討論

PCOS 是導致育齡期婦女無排卵性不孕的主要病因[9]，患者臨床主要表現為持續無排卵和高雄激素血癥，B 超檢查可見卵巢呈現多囊樣改變[10]。無排卵性不孕的主要原因為卵泡發育障礙， 導致其發育停滯于竇狀卵泡階段，無法進行有效排卵[11]。近年來有研究表明， 在細胞各功能中起重要作用的miRNA 參與了多種疾病的發生發展過程，被作為各種疾病的診斷或預后生物標志物在臨床中廣泛應用[12]。 本研究主要探討PCOS 患者GCs 中miR-3135b 的表達，并分析其臨床意義。

本研究對PCOS 導致不孕患者與因輸卵管或男方不育等原因導致不孕患者的一般資料和臨床特征進行對比分析，結果顯示兩組在LH、LH/FSH、P、T、FINS、HOMA-IR、E2、FSH 和PRL 差異有統計學意義。 其中，LH 和LH/FSH 顯著說明PCOS 患者出現促性腺激素功能失調，T 水平升高提示高雄激素血癥， 而FINS、HOMA-IR 升高則說明PCOS 患者出現高胰島素血癥和胰島素抵抗， 這與孫守萍等[13]研究結果基本一致，證實了PCOS 具有高雄激素血癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗和促性腺激素功能失調等生化特征。 本研究中，兩組患者初始卵泡、閉鎖卵泡數和胚胎形成率無顯著差異，與對照組比，PCOS 組過渡型初級卵泡、典型初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡數和獲卵數明顯增多，說明PCOS患者早期初級卵泡、 次級卵泡和竇卵泡數呈現增多趨勢，與Pedroso[14]實驗結論基本一致，但Pedroso發現PCOS 患者卵泡刺激素顯著降低，分析其原因可能與PCOS 引起的卵巢功能障礙有關。

本研究采用qRT-PCR 檢測miR-3135b 在PCOS 患者GCs 中的表達，結果顯示其表達與在對照組患者中的表達存在顯著的統計學差異， 與非PCOS 的對照組患者比較，PCOS 組中miR-3135b表達上調， 其表達量顯著高于對照組患者， 提示miR-3135b 可能在PCOS 發病機制中具有重要作用。 卵巢GCs 是由原始卵泡中扁平卵泡細胞增殖形成的柱狀多層顆粒細胞， 在成熟卵泡時期停止增殖，可傳遞營養物質和激素，在卵泡發育過程中發揮重要作用[15-16]。 卵泡發育異常是導致患者不孕不育，甚至自發性流產的主要原因[17]。有研究顯示，卵巢GCs 中的miRNAs 以轉錄后調控方式參與生殖過程的調節，并調控激素合成，其異常表達與卵泡生長、發育關系密切[18]。 miR-3135b 可能通過降低增殖細胞核抗原表達， 達到抑制卵巢GCs 增生的目的。 miRNAs 對卵巢GCs 中E2、P 和T 等激素的分泌也有抑制作用， 可進一步影響卵母細胞的生長和發展[19]。 本研究結果證實，PCOS 患者GCs中miR-3135b 呈現高表達，Wang Y[20]的研究發現，PCOS 患者存在多種miRNAs 的差異表達， 其中miR-3135b 在PCOS 患者的GCs 中呈現更高的表達，可提高對PCOS 的預測準確性，這與本研究結論基本一致。 本研究采用ROC曲線分析了miR-3135b 表達對PCOS 的診斷價值， 結果顯示miR-3135b 表達診斷PCOS 的AUC為0.750， 說 明miR-3135b 表達具有較好的PCOS 診斷價值。

綜上所述，miR-3135b 在PCOS 患者GCs 中呈現高表達，在卵泡發育障礙中發揮重要作用，且對PCOS 診斷具有較好的預測價值。 本研究的不足之處在于未對與PCOS 患者卵泡發育相關的miR-3135b 信號通路進行系統闡述，后續仍需加大樣本量進行深入研究， 但本研究仍為臨床進一步了解PCOS 的病理生理機制提供了新思路。