NF-κB、TGF-β1 與風濕性心臟病心房顫動患者心房纖維化的關系

陳剛，賀少功，李偉

（河南省平頂山市中醫院，河南 平頂山 467000）

RHD 是由急性風濕熱（Acute rheumatic fever,ARF）加重或反復發作導致的心臟瓣膜損傷引起的一種慢性瓣膜病變，ARF 是由遺傳易感個體對甲型鏈球菌引起的感染的自身免疫反應引起的[1-2]。AF 在心血管疾病患者中變得越來越常見， 包括RHD、高血壓、冠心病、先天性心臟病、心肌病和心包疾病等[3]。 AF 可能誘發惡性心律失常、附壁血栓的發生，出現主要不良心血管病變，將嚴重影響人體健康[4]。有研究表明，心房結構重構發生在AF 的發作和發展過程中， 將導致左心房擴張和左心室射血分數（LVEF）下降[5-6]。然而，預防或改善心肌纖維化可能會顯著降低AF 患者的左心房擴張并改善心功能[7]。 因此，抑制心房纖維化可能是預防AF發展的關鍵。 心肌纖維化是心臟病病變的一個重要組成特征， 其特征是細胞外基質的過度表達和原纖維膠原的積累[8]。心肌中有五種膠原（即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型），其中Ⅰ型和Ⅲ型最常見[9-10]，主要導致心臟疾病進展中的心肌纖維化[11]。NF-κB 是一種轉錄因子，控制與免疫和炎癥反應、細胞生長和黏附有關的基因轉錄， 在大多數細胞中普遍表達[12]。TGF-β1 是迄今發現的最有效的促纖維化細胞因子， 也是導致心臟成纖維細胞活化和纖維化的關鍵介質，屬于TGF-β 超家族的一個亞家族，能夠調節增殖、生長抑制、細胞遷移和侵襲、肌成纖維細胞轉化和細胞外基質重塑[13]。本研究檢測并比較了兩組患者的NF-κB、TGF-β1 水平的變化， 分析RHD 伴發AF 患者的心房纖維化與NF-κB、TGFβ1 之間的關系，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過回顧分析2019 年1 月至2020年12 月于我院行心臟瓣膜置換術的RHD 患者100 例。 排除標準：（1） 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、慢性肺源性心臟病、感染性心內膜炎等心臟病變患者；（2）甲狀腺功能亢進患者；（3）嚴重肝、腎或肺功能障礙或惡性腫瘤患者；（4）服用可以減輕心室重構的藥物的患者， 包括血管緊張素轉換酶抑制劑、 血管緊張素受體阻滯劑、β 受體阻滯劑和螺內酯等。 其中AF 者62 例為AF 組，SR 者38 例為SR 組。 收集入組患者的一般臨床資料，如年齡、性別、左心房內徑（LAD）、LVEF、心功能分級等。其中，SR 組患者最大年齡80 歲， 最小年齡63 歲，平均年齡（68.73±5.28）歲。

1.2 研究方法及觀察指標

1.2.1 采集標本 所有患者都進行了心臟瓣膜置換手術，在此期間從每個患者中收集約200 mg 右心房組織。每個樣品被分成兩部分。一部分迅速放入液氮容器中，然后放入-80 ℃冰凍保存；另一部分用鹽水溶液洗滌，隨后在室溫下浸泡在4%多聚甲醛溶液中用于病理分析。

1.2.2 HE 染色檢測心房肌細胞的形態學變化 右心房組織在室溫下固定在4%多聚甲醛溶液中至少24 h，并包埋在石蠟中。 將厚度約4 μm 的切片放在干凈的帶正電荷的顯微鏡載玻片上。 干燥后，將載玻片在60 ℃環境中加熱。在脫蠟和再水合后，洗滌載玻片，用蘇木精染色7 min，用0.3%酸性醇區分，在斯科特的自來水替代物中漂洗，用蘇木紅染色2 min，然后脫水、清除并固定。 所有上述實驗都在室溫下進行。 光學顯微鏡被用來觀察載玻片。

1.2.3 Masson 染色測定心房肌間質和血管周圍的膠原沉積 在脫蠟和再水合后，載玻片被洗滌并在56 ℃的布恩溶液中重新固定1 h， 以提高染色質量。 然后用韋格特的鐵蘇木精染色載玻片5 min，在酸性品紅溶液中染色8 min，然后在磷鉬酸溶液中染色5 min。 載玻片隨后用苯胺藍溶液染色，在1%乙酸中分化，快速脫水，在二甲苯中清除，并使用樹脂固定介質固定。 Masson 染色的所有步驟都在室溫下進行。 藍色染色顯示膠原蛋白的存在，紅色染色顯示肌肉和細胞質的存在。 使用光學顯微鏡拍攝高倍光學顯微照片。 使用image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics, Inc. Rockville, MD, USA）測定膠原蛋白體積分數（CVF）。

1.2.4 WB 測定心房肌中NF-κB 磷酸化水平 使用放射免疫沉淀分析裂解緩沖液從-80 ℃冰凍保存的右心房組織中提取總蛋白，BCA 蛋白檢測試劑盒用于測定蛋白濃度。 使用10% SDS-PAGE 加載和分離變性蛋白，然后轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，用5%非脂肪乳封閉60 min 后，將膜與初級抗體在4 ℃孵育過夜。 第二天，將膜與辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔孵育， 作為第二抗體在室溫下放置2 h。ChemiDoc 觸摸成像系統用于檢測蛋白質信號，并使用Bandscan 4.3 進行分析。

1.2.5 RT-qPCR 測定心房肌中TGF-β1 水平 使用TRIzol 試劑從-80 ℃冰凍保存的右心房組織中分離總RNA。 定量聚合酶鏈反應在Illumina-Eco機器上進行， 根據β 肌動蛋白基因表達對結果進行標準化。 反應條件為50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s。用1 g 總核糖核酸進行逆轉錄聚合酶鏈反應實驗，然后進行40 個循環的聚合酶鏈反應擴增。 通過分析Cq值和標準曲線，使用熒光信號的變化來量化表達水平；使用RUO ViiA 7 軟件對起始模板進行定量分析。

1.3 統計學方法 將所采集數據輸入Excel 2013表建立量表數據庫。 將所有資料導入計算機，采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。 計數資料以頻數表和百分率表示，采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，采用t檢驗；用Pearson相關進行相關性分析。以α=0.05 為統計學檢驗標準，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的一般資料比較情況 AF 組患者的LAD 明顯大于SR 組患者，兩者之間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 兩組患者的一般資料比較

2.2 兩組患者的心肌組織比較情況 HE 染色顯示，AF 組心肌細胞大于SR 組。 AF 組表現出間質膠原纖維排列紊亂。 此外，AF 組的CVF 值明顯高于SR 組，具有統計學意義（P＜0.05）。 見圖1。

圖1 RHD 伴發AF 患者擴張的心房肌細胞和積聚的膠原

2.3 兩組患者的NF-κB、TGF-β1 水平比較情況與SR 組相比較，AF 組患者的NF-κB、TGF-β1 水平均明顯升高，兩者之間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 兩組患者的NF-κB、TGF-β1 比較

2.4 RHD 伴發AF 患者心房纖維化和NF-κB、TGF-β1 相關性情況 RHD 伴發AF 患者右心房CVF 與NF-κB、TGF-β1 水平呈正相關關系， 差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表3。

表3 RHD 伴發AF 患者心房纖維化和NF-κB、TGF-β1 相關性

3 討論

ARF 是遺傳易感個體對GAS 咽部感染的自身免疫反應的結果， 鏈球菌抗原由抗原呈遞細胞如巨噬細胞和樹突狀細胞識別、加工和呈遞，導致B細胞產生抗體，B 細胞與人成分交叉反應， 導致多個宿主部位的損傷[14]。心臟瓣膜的長期損傷是ARF更嚴重的并發癥。

有研究報道RHD 的免疫反應可能與膠原自身免疫有關，宿主內皮產生抗基底膜膠原（Ⅳ型）自身抗體是病理過程的觸發步驟。 在鏈球菌感染中，M 蛋白與Ⅳ型膠原的CB3 區結合，導致形成一種復合物，促進膠原結構的構象變化，從而啟動抗膠原反應[15]。 因此，一種普遍存在的蛋白質可以成為自身抗原， 導致膠原沉積和膠原降解之間的不平衡，最終導致RHD 的纖維化。 與非風濕性二尖瓣對照相比， 風濕性心臟病患者的二尖瓣顯示出較高的Ⅰ型和Ⅲ型膠原沉積， 這是纖維化的證據[16]。

為探討AF 對心房結構重構的影響， 采用HE染色和Masson 染色評估心肌纖維化程度。 HE 染色顯示，AF 組心肌細胞大于SR 組。 通過測量心肌組織間質中膠原的總量和測定CVF 來評價心肌纖維化。 與SR 組相比，AF 組表現出間質膠原纖維排列紊亂。 此外，AF 組的CVF 值明顯高于SR 組，有統計學意義 （P＜0.05）。 這些結果表明，RHD 伴發AF 患者具有擴張的心房肌細胞， 并在心房肌中顯示廣泛的膠原沉積。 心房纖維化是心房結構重塑發生的主要過程，在AF 的發生發展過程中起著關鍵作用， 減輕心房纖維化以抑制心房結構重塑對預防AF 的發生和發展至關重要[17]。 此外，心房纖維化是由心臟成纖維細胞和上皮細胞介導的，內皮細胞可以轉化為成纖維細胞， 這在心臟肥大和心臟纖維化中發揮重要作用[18]。 因此，抑制心肌間質轉化以減輕心肌纖維化可能是預防AF 發展的重要途徑。

本研究相關性分析結果顯示，RHD 伴發AF患者的NF-κB、TGF-β1 水平與右心房CVF 呈正相關，考慮是因為TGF-β1 能夠通過上皮細胞和間充質細胞在培養中促進纖連蛋白和膠原蛋白的產生，并通過相關基因轉錄激活NF-κB，是心房纖維化的潛在關鍵驅動因素[19-20]。

綜上所述，RHD 伴發AF 患者心肌組織中NF-κB 激活可能促進分泌TGF-β1，引起細胞外基質沉積，導致心房纖維化。