非小細胞肺癌患者血漿EGFR基因c.2572_2573delinsAG位點突變1例報道

陳馨寧 黃 斐 姜惠琴 沈敏娜 潘柏申 王蓓麗 郭 瑋

（復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032）

使用血液樣本進行血漿表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因檢測已經成為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）臨床診療的關鍵環節[1]。本研究報道1例EGFR：c.2572_2573delinsAG陽性NSCLC患者，采用改進的突變擴增阻礙系統（super amplification refractory mutation system，Super-ARMS）檢測血漿循環游離DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），未檢出該突變；采用抑制探針置換擴增（blocker displacement amplification，BDA）法檢出該突變位點。

1 病例資料

1.1 簡要病史

患者，男，87歲，發現肺部惡性腫瘤1年，因無癥狀未行治療，2020年11月31日主訴“近期胸痛、吞咽困難”就診。2020年12月1日行單光子發射計算機斷層成像術/電子計算機斷層掃描顯像結合全身骨平面顯像，考慮為全身多處骨轉移。

1.2 血漿EGFR基因檢測結果

采集患者靜脈血10 mL，乙二胺四乙酸抗凝。采用兩步離心法，4 ℃ 1 600×g離心10 min，分離血漿，4 ℃ 16 000×g再次離心10 min，吸取上清4 mL，采用核酸提取試劑（廈門艾德生物醫藥公司）抽提ctDNA，分別采用Super-ARMS和BDA法檢測。Super-ARMS試劑盒購自廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司，BDA法試劑盒購自上海閱爾基因技術有限公司，檢測儀器均為7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

血漿EGFR基因檢測結果見圖1。Super-ARMS未檢出EGFR突變，BDA法檢出EGFR基因21號外顯子L858R突變，位點為c.2572_2573delinsAG，該位點不在Super-ARMS檢測范圍內。

圖1 患者血漿EGFR基因突變檢測結果

隨后使用Sanger測序[委托鉑尚生物技術（上海）有限公司進行，上游引物為5'-GCTCCCAGTACCTGCTCAAC-3'，下游引物為5'-TGATAGGCACTTTGCCTCCT-3']和二代測序[試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，檢測儀器為 MiSeq測序儀（美國Illumina公司）]進行復核，結果同BDA法。同時，為避免存在克隆造血影響，對患者基因組DNA中該位點進行檢測，結果為陰性。

2 討論

Super-ARMS技術基于ARMS，是腫瘤相關分子檢測的主要技術之一，檢測下限為0.2%～0.8%[2-3]?；谠摷夹g的EGFR試劑盒是中國國家藥品監督管理局首次按照伴隨診斷試劑標準審評并批準上市的產品。BDA法是基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）的突變富集技術，在野生型DNA背景下選擇性地擴增基因突變，利用引物和抑制探針之間的競爭關系提高PCR的效率和低豐度突變檢出率，檢測下限為0.01%～0.10%[4]。

基于特定突變位點探針和引物的PCR方法只能檢測有限數量和已知的特異性突變，而測序可以揭示所有分析序列中的異常，包括罕見和未知突變，見圖2。由于Sanger測序靈敏度相對較低（10%），因此采用BDA技術補充檢測EGFR第18～21號外顯子全部突變，具有在常規EGFR基因突變基礎上獲得更多臨床和科研價值[5]的優勢。

圖2 3種檢測方法原理

EGFR基因與腫瘤的發展、增殖、侵襲和轉移密切相關，根據EGFR基因突變結果指導NSCLC患者進行表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治療已經成為標準臨床實踐方法[1]。然而，臨床診療過程中肺癌組織受檢率并不高，導致基于驅動基因突變靶點的個體化治療策略難以實施。多項回顧性和前瞻性研究結果均表明，當腫瘤組織難以獲取時，血液ctDNA檢測是合適的突變分析替代選擇[1]。和傳統活檢相比，液體活檢具有無創、可實時檢測、克服腫瘤異質性等特點。因此，血液EGFR基因突變檢測的臨床價值逐漸突顯[6]。

EGFR基因21 號外顯子L858R 突變占所有突變的32%，常見的突變形式為c.2573T＞G，也有c.2573_2574delinsGT和c.2573_2574delinsGA突變相關報道[7]。本例患者檢出的c.2572_2573delinsAG位點也屬于L858R突變，但鮮有報道。L858R突變患者為EGFR敏感突變，此類患者酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的療效優于化療。因此，L858R突變的檢出無疑增加了患者的治療選擇和機會。除了常見突變外，其余突變也可以幫助臨床為患者做出更好的臨床決策。非經典突變主要包括G719X（18號外顯子）、S768I（20號外顯子）、L861Q（21號外顯子）突變[8]，目前基本已包括在基于PCR方法的商品化診斷試劑盒的檢測范圍內。但另有罕見突變，如18del、E709X和19ins，其發生頻率＜0.5%，在非測序方法中被忽視。E709X對一代TKI的反應介于經典EGFR突變和EGFR野生型之間。18del、E709X和19ins均對二代TKI敏感，但相關臨床數據較少，僅有相關病例報道患者治療后獲部分緩解[9]。此外，常見突變類型中特定的突變位點可能對TKI表現出獨特甚至相反的選擇性，如EGFR基因第19外顯子缺失中p.L747-A750＞P與其他缺失類型相比，患者接受厄洛替尼治療獲得的臨床結局更差[10-11]；除p.A763_Y764insFQEA和p.A763_Y764insLQEA外，攜帶EGFR基因第20外顯子插入的患者對EGFR-TKI治療普遍不敏感[12-13]。因此，更深入、更全面地開展腫瘤分子檢測可以幫助了解罕見突變如何影響EGFR蛋白結構和TKI結合效力[14-15]，為NSCLC患者提供更有價值的治療見解，以實現精準的個體化治療。