膠質硅法和鞣花酸法APTT檢測臨床應用效果比較

劉 偉 郭戰萍 郝迎軍 宋媛媛

（新鄉市中心醫院檢驗科，河南 新鄉 453000）

活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）檢測常用于評價內源性凝血途徑異常，也可用于分析凝血因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ或纖維蛋白原功能缺陷[1]。口服抗凝劑或非特異性抑制劑，如狼瘡樣抗凝物（lupus anticoagulant，LA），可導致APTT延長。APTT還可用于評價臨床肝素抗凝效果，是一個重要的篩查指標，對血栓性疾病、出血和凝血性疾病的診斷和治療有重要的臨床意義。

目前，臨床實驗室主要通過在血漿中加入鞣花酸、膠質硅等激活劑和磷脂（部分凝血活酶）、鈣離子來測定APTT。本研究旨在探討不同激活劑對APTT測定結果的影響，并比較基于不同激活劑的試劑檢測凝血因子、LA的敏感性，建立臨床普通肝素抗凝治療范圍，為臨床診療提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

采用含10%枸櫞酸鈉（109mmol/L）抗凝劑的真空采血管（容量3 mL）采集新鄉市中心醫院住院、門診患者和健康體檢者無溶血、無凝固、無黃疸、無脂靜脈血標本156例，其中100例為2周內未行肝素、華法林、阿司匹林等抗凝藥物治療患者的常規送檢LA的樣本，56例為行普通肝素抗凝治療患者樣本，采集后輕輕顛倒混勻，1 006×g離心15 min，分離血漿，進行相關檢測。

1.2 儀器和試劑

CS 5100自動凝血分析儀和APTT檢測試劑盒（Hemosil SynthAsil試劑，簡稱HS試劑，激活劑為膠質硅；Dade Actin Activated Cephaloplastin Reagent試劑，簡稱DAACR試劑，激活劑為鞣花酸）均購自日本希森美康醫用電子（上海）有限公司。肝素鈉注射液（1.25萬U/2 mL，國藥準字H32023409）購自江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司。凍干乏Ⅻ、乏Ⅺ、乏Ⅸ、乏Ⅷ因子血漿和凍干標準血漿購自德國西門子公司。

1.3 方法

分別以膠質硅和鞣花酸為激活劑，采用CS 5100全自動凝血分析儀測定100例臨床標本和42份含有不同濃度肝素鈉（每份血漿含肝素鈉終濃度分別為0.625、0.417、0.313、0.250、0.178、0.104、0.000 U/mL）血漿標本的APTT。檢測前先使用質控血漿進行測定，質控在控后再檢測臨床標本。

1.4 LA檢測敏感性評價

收集新鄉市中心醫院門診或住院患者常規送檢LA的標本100例。采用2種試劑檢測APTT，比較2種試劑檢測LA的敏感性。患者納入標準：2周內未行肝素、華法林、阿司匹林等抗凝藥物治療。以凝血酶原國際標準化比值（international normalized ratio，INR）＞1.20為LA陽性，以INR＞1.50為中至強陽性。

1.5 凝血因子檢測敏感性評價

根據美國臨床實驗室標準化學會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）H47-A2文件[2]要求評價APTT因子敏感性：按比例將凍干標準血漿與單因子缺乏血漿（凍干乏Ⅻ、乏Ⅺ、乏Ⅸ、乏Ⅷ因子血漿）配制成不同單凝血因子活性的混合血漿，使凝血因子活性為1%～100%。所有標本均在采集后4 h內完成測定。凝血因子檢測敏感性基于非線性回歸曲線與參考區間上限交叉點百分活度（%）評價。

1.6 普通肝素抗凝治療范圍的建立和動態監測趨勢比

分別用2種試劑檢測54例行普通肝素抗凝治療患者血漿APTT，同時檢測血漿肝素濃度（抗Ⅹa活性），將APTT和血漿肝素濃度（抗Ⅹa活性）檢測結果進行線性回歸分析，確定抗Ⅹa活性為0.3～0.7 IU/mL時相應的APTT。隨機選取2例行普通肝素抗凝治療的患者，收集其連續監測數據，評價2種試劑APTT檢測結果的變化趨勢是否一致。

1.7 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量數據以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2種試劑檢測結果比較

以鞣花酸為激活劑的DAACR試劑APTT檢測結果為（29.5±4.8）s，以膠質硅為激活劑的HS試劑APTT檢測結果為（38.2±8.1）s，2種試劑檢測結果差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 含不同濃度肝素鈉血漿標本2種試劑APTT檢測結果

隨著肝素鈉濃度的增加，以鞣花酸為激活劑的DAACR試劑和以膠質硅為激活劑的HS試劑APTT檢測結果均明顯延長；DAACR試劑組變化更明顯。見表1。

表1 含不同濃度肝素鈉血漿標本2種試劑APTT檢測結果 s

2.3 2種試劑檢測LA的敏感性比較

100例常規送檢LA的標本INR為0.72～2.52，其中LA陽性54例，LA中至強陽性32例；以膠質硅為激活劑的HS試劑APTT檢測結果為22.5～62.8 s，以鞣花酸為激活劑的DAACR試劑APTT檢測結果為19.8～61.1 s。54例LA陽性標本中，HS試劑和DAACR試劑陽性檢出率分別為42.9%和55.1%，差異有統計學意義（P＜0.01）；32例LA中至強陽性標本中，HS試劑和DAACR試劑陽性檢出率分別為54.3%和69.8%，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 2種試劑凝血因子檢測敏感性

HS試劑參考區間上限為37.2 s，DAACR試劑參考區間上限為32.1 s。HS試劑檢測凝血因子Ⅷ的敏感性＞50%（超敏感），檢測凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅺ、凝血因子Ⅻ的敏感性為30%～50%（中度敏感）。DAACR試劑檢測凝血因子Ⅺ的敏感性＞50%（超敏感），檢測凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅻ的敏感性為30%～50%（中度敏感）。見表2。

表2 2種試劑檢測凝血因子的敏感性 %

2.5 臨床普通肝素抗凝治療范圍

抗Ⅹa活性為0.3～0.7 IU/mL時，HS試劑檢測APTT對應的普通肝素治療范圍為56.9～104.7 s，DAACR試劑對應的普通肝素治療范圍為45.3～78.2 s（圖1）。抗Ⅹa活性＞0.8 IU/mL時，DAACR試劑和HS試劑檢測APTT結果差異較大。2種試劑連續監測2例樣本的趨勢一致（表3、表4、圖2）。

圖1 2種試劑普通肝素抗凝治療范圍

圖2 普通肝素治療患者連續監測樣本APTT檢測結果變化趨勢

表3 病例1（普通肝素治療）2種試劑連續監測APTT結果 s

表4 病例2（普通肝素治療）2種試劑連續監測APTT結果 s

3 討論

凝塊激活部分的凝血活酶時間測試最早出現于1954年，當時為復鈣時間測定法，隨后發展為部分凝血活酶時間（partial thromboplastin time，PTT），并添加了一種由磷脂組成的兔腦組織提取物（腦磷脂），作為血小板替代物，因為不包括組織因子，被認為是“部分凝血活酶”。當添加帶負電荷顆粒的接觸活化劑（高嶺土、二氧化硅、鞣花酸或硅藻土）以提高反應性和重現性時，被稱為“活化”[3]。目前，大多APTT試劑使用的是大豆基合成磷脂和非沉降活化劑（膠體二氧化硅）。當一種APTT試劑被加入乏血小板血漿中時，可通過激活凝血因子Ⅻ在體外觸發血栓形成[4]。APTT可對內在和/或共同途徑中的缺陷作出反應，并隨共同途徑中顯著單因素缺陷或多個缺陷延長。CLSI H47-A2文件[2]指出：對于APTT試劑及其檢測系統，當內源性凝血因子Ⅷ、Ⅸ或Ⅺ活性降低到約30%（0.3 IU）或更低時，APTT應表現為延長；纖維蛋白原水平降至2.94 μmol/L（100 mg/dL）以下時，APTT才會延長。本研究中，2種試劑對凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的敏感性均＞30%，符合CLSI的要求。激活劑是影響APTT試劑檢測凝血因子敏感性的重要因素[5-6]。本研究中，以鞣花酸為激活劑的DAACR試劑檢測內源性凝血因子的敏感性高于以膠質硅為激活劑的HS試劑，也證實了這一點。

LA是一種能作用于磷脂或磷脂蛋白質復合物的IgG或IgM型免疫球蛋白，屬于“抗磷脂抗體”家族[7]。LA與抗磷脂綜合征、靜脈和動脈血栓形成，以及產科并發癥相關的血栓密切相關[8]，是病理性循環抗凝物質，對依賴磷脂的各種途徑的凝血和抗凝因子具有干擾作用，可影響凝血反應，延長凝血時間。實驗室基于LA在體外實驗中表現出的抗磷脂作用導致的凝血時間延長來判斷機體是否存在LA[9-10]。不同試劑對LA的敏感性與磷脂的含量、來源、濃度和組成，特別是磷脂酰絲氨酸含量密切相關。另外，激活劑類型也很重要。有研究發現，HS試劑含有硅成分的活化劑，更適用于LA檢測[11]。

APTT還被用于監測普通肝素的抗凝作用，目前，監測普通肝素抗凝作用最常用的2種方法是APTT和抗凝血因子Ⅹa（抗Ⅹa）肝素測定。APTT檢測比抗Ⅹa檢測更易自動化，成本更低[9]。APTT主要是對凝血級聯固有和共同途徑功能的檢測，普通肝素抗凝目標治療范圍以魚精蛋白滴定法測定相應肝素濃度0.2～0.4 U/mL為基礎，或以抗凝劑Ⅹa測定法測定相應肝素濃度0.3～0.7 U/mL為基礎[12]，但受不同試劑差異和一些不能反映肝素活性生物因素影響[13-14]，每批新的APTT試劑都必須進行性能驗證或更新目標范圍；不同試劑對Ⅹa和Ⅱa因子的抑制反應不同，指導肝素治療，應建立一個試劑特異性APTT治療范圍，相當于肝素濃度（抗Ⅹa活性）0.3～0.7 U/mL。

本研究中，當抗Ⅹa活性為0.3～0.7 IU/mL時，HS試劑APTT檢測對應的普通肝素治療范圍為56.9～104.7 s，DAACR試劑APTT檢測對應的普通肝素治療范圍為45.3～78.2 s。抗Ⅹa活性＞0.8 IU/mL時，DAACR試劑和HS試劑APTT的檢測結果差異較大；2種試劑對2例患者連續監測標本的檢測結果顯示，APTT的變化趨勢一致。

綜上所述，分別以膠質硅和鞣花酸為激活劑的2種試劑均能滿足臨床對凝血因子、LA敏感性的需求，但對肝素、LA、凝血因子敏感性差異較大。本研究分別確定了DAACR試劑、HS試劑檢測APTT對應的普通肝素治療范圍。試劑對APTT測定的影響應引起臨床重視，實驗室應針對相應試劑與儀器建立自己的參考區間，從而更好地指導臨床合理用藥。