三種抗菌藥物微生物限度檢查方法學驗證研究

蔣天逖，曹聰聰

（長沙醫學院，湖南長沙 410219）

對于非規定滅菌制劑及其原料、輔料的微生物污染程度的檢查，《中國藥典》制定了微生物限度檢查法[1]，主要檢查項目有需氧菌總數、霉菌數和酵母菌總數及控制菌（指藥品中特定的菌體）檢查[2]。藥品微生物限度檢查的主要目的是通過微生物數量的定量檢測以準確反映藥品侵蝕程度，繼而確定樣品微生物具體含量[3]。

微生物在日常生活中不可或缺，可參與大自然循環，分解有機物，產生代謝產物，其中部分代謝產物會導致人畜疾病、食物腐敗或霉爛等，具有分布廣、種類多、繁殖快的特點[4]。在藥品中，可造成藥物污染的微生物種類繁多，如生活中隨處可見的細菌、酵母菌和霉菌，其中絕大部分是致病菌。由于藥物在生產過程中原料、輔料和生產工藝的差異，不同種類藥物受到微生物污染程度也不盡相同。而藥品在生產過程中受污染的微生物越多，其變質越快，有效期越短，甚至將導致服藥者產生發熱、感染、中毒、過敏等不良反應，從而造成各種臨床疾病的可能性就越多[5-6]。

研究表明，導致藥物活性降低的原因一般有兩種：（1）部分微生物存在于藥品中，繼而導致部分藥品效果缺失或完全喪失；（2）樣品存儲年限較久而導致其部分失效[7-8]。因此，藥品生產、流通、儲存等環節均需嚴格遵循相應的質量把控、管理規范，從而最大限度降低藥品受到微生物污染的風險及污染程度。為實現上述目標，驗證不同抗菌藥物的微生物限度檢查方法有效性，改善相關檢測技術也非常必要。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BSC-1500IIA2 生物安全柜，上海中庸檢驗設備有限公司；SW-CJ-2D 超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；HTY 無菌隔離器，浙江泰林生物技術股份有限公司；HR 封閉式/開放式兩用無菌檢查薄膜過濾器，北京恒瑞天創機電設備有限公司；標準型PH 計PB-10/C，上海精密科學儀器有限公司；移液槍，上海精密科學儀器有限公司；FC104 電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；智能高壓蒸汽滅菌器，艾德生儀器有限公司；25℃SPX-250B-Z 型生化培養箱、35℃SPX-250B-Z 型生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；勻漿儀，杭州高得醫療器械有限公司。

大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]、白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]，0.5 ～1.0×103cfu/顆，中國食品藥品檢定研究院。營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、BL增菌培養基、沙氏培養基，中國藥品生物制品檢定所；培養基所用蛋白胨、氯化鈉等其他試劑均由廣東翁江化學試劑有限公司提供。鹽酸莫西沙星（批號：180304）、諾氟沙星（批號：180210）、阿奇霉素（批號：180401），湖南迪諾制藥有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沖洗劑制備

配置0.9%氯化鈉溶液和0.1%蛋白胨氯化鈉緩沖液，高壓滅菌后備用。

1.2.2 菌液制備

取兩種新鮮培養物（金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌）同時分別接種到營養肉湯培養基，而后取白色念珠菌新鮮培養物接種到沙氏液體培養基，按《中國藥典》描述的具體方法，將其制備成50 ～100 個/mL水平，分為一式三份待用。

1.2.3 供試液制備

取10 g 藥物樣品到100 mL 無菌氯化鈉溶液（濃度0.9%），制成供試液（1 ∶10），若存在不溶性顆粒，則可500 r/min 離心處理5 min，而后取上層液體，確保供試液均勻。

1.2.4 試驗方法

1.2.4.1 平皿菌落計數法（平皿法）

采用常規平皿傾注法進行試驗。分別取1 ∶10的供試品溶液9.9 mL，加入試驗菌液各0.1 mL，充分混勻后吸取混合溶液1 mL 至無菌平皿中，傾注胰酪胨大豆瓊脂培養基，先后經過混勻、凝固等操作步驟，平行制備2 組。將大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌在30～35 ℃培養3 d，白色念珠菌在30～35 ℃培養5 d。計數，計算各組的平均菌落數。

1.2.4.2 洗脫法

取供試液使用直徑為50 mm、孔徑0.45 μm 的濾膜進行減壓抽濾，而后取出濾膜使用100 mL滅菌生理鹽水緩慢流動沖洗，總用量不超過1 000 mL。取1 mL沖洗液放入雙碟中，先后加入等量的營養瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂培養基，并先后在35 ℃培養48 h、27 ℃培養72 h 后取出計算菌數。

1.2.4.3 薄膜過濾法（薄膜法）

分別取1 ∶10 的供試品溶液1.0 mL 至薄膜過濾器中，用0.7%氯化鈉蛋白胨溶液沖洗3 次，每次用量100 mL，在最后一次沖洗前加入0.1 mL 菌液進行過濾，轉移濾膜，將細菌表面貼于胰蛋白酶瓊脂培養基上，按規定培養計數。

1.2.4.4 回收率測定

分別取前述步驟中制備的菌液，將其稀釋至指定濃度（30 ～100 cfu/mL），而后將其加入至供試液中，并取1 mL 溶液進行培養基計數，計算回收率。

1.2.5 數據分析

實驗過程中的數據收集整理采用Excel 2010軟件。

2 結果與分析

2.1 樣品檢出情況

使用三種藥物重復實驗3 次，平皿菌落計數法細菌數、洗脫法細菌數、薄膜過濾法細菌數具體見表1?？梢钥吹?，3 種藥物供試樣品中薄膜過濾法檢出細菌數均最多。

表1 三種方法樣品檢出細菌數（單位：個/g）

2.2 回收率

如表2 所示，3 種藥物使用薄膜過濾法檢測細菌回收率均最高，鹽酸莫西沙星中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和白色念珠菌的回收率分別為78.00%、81.25%、75.38%，諾氟沙星中的回收率分別為70.00%、72.50%、84.62%，阿奇霉素中的回收率分別為72.00%、75.00%、80.00%。

表2 三種驗證方法對菌種的回收率

2.3 討論

需氧菌總數、霉菌數、酵母菌總數及控制菌（指藥品中特定的菌體）等是非規定的滅菌制劑（及其原料）、輔料等藥品組分中微生物存在情況及具體污染程度的主要檢查項目。本試驗研究中采取薄膜過濾法檢查鹽酸莫西沙星、阿奇霉素和諾氟沙星的需氧菌總數、控制菌（大腸埃希菌）總數和鹽酸莫西沙星的霉菌數，所得結果均符合《中國藥典》規定。三種抗菌藥物微生物限度檢查結果比較，莫西沙星的抑菌活性強于其余兩者，通過不同稀釋級供試液和不同檢查方法得出薄膜過濾法適用于鹽酸莫西沙星、阿奇霉素和諾氟沙星的微生物限度檢查[9]。

本研究發現薄膜法樣品中菌數測定結果和回收率顯著高于平皿法和洗脫法，可能與以下原因有關。（1）平皿菌落計數法是將供試液按照設定程度予以稀釋后直接接種于平皿并進行菌數測定的方法，雖然稀釋劑和培養基會對抗菌藥物中的抑菌成分進行稀釋，其抑菌能力有所降低，但是不至于完全消失，因此會影響細菌的生長過程，同時降低其檢出率和回收率。（2）洗脫法的操作過程中細菌會吸附在濾膜表面或鑲嵌在纖維膜的間隙中，很難通過沖洗洗脫下來，因此會出現檢出率和回收率低。（3）薄膜法在具體操作過程中則會使用稀釋液對濾膜進行反復沖洗，該處理方式會極大降低抑菌成分濃度，甚至在微生物限度檢查層面會降低原有成分的抑菌效果。需要注意的是，在具體操作過程中，薄膜過濾法必須首先將供試液加入濾罐中，先混勻沖洗液再進行減壓抽濾，否則抑菌成分不能徹底去除，將直接影響測定結果[10]。

3 結論

薄膜法在過濾樣品過程中，將微生物留在濾膜表面，藥品中的抑菌成分則在無菌沖洗液的反復沖洗下有效去除，培養過程中其營養成分和代謝物也可以通過濾膜上的微孔不斷進行交換。總的來說，薄膜法不僅能增大取樣量，實驗結果更具代表性，還可以有效減少外部環境或操作因素的干擾，操作過程更為方便實用，簡化了微生物的檢測程序，可在相關領域推廣應用。