乙酰膽堿酯酶檢測方法研究進(jìn)展

焦雯，周文清，章文，許貫虹

（南京醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇南京211166）

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）具有羧肽酶和氨基肽酶的活性，可以降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，減弱乙酰膽堿對突觸后膜的作用。AChE 在神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)活動中起關(guān)鍵作用，其功能異常可導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。建立高選擇性與高靈敏度的AChE 檢測方法有助于深入理解相關(guān)生命活動，為相關(guān)疾病的藥物研發(fā)提供有力支持。迄今為止，研究者已經(jīng)報道了包括比色法、熒光法、電化學(xué)法在內(nèi)的一系列檢測方法，其中尤以比色法和熒光法備受關(guān)注。本文將重點綜述上述方法，并對其發(fā)展趨勢予以展望。

1 比色法

1.1 Ellman 法

Ellman 法是測定AChE 的傳統(tǒng)方法，其基本原理是：乙酰膽堿酯酶水解底物乙酰膽堿產(chǎn)生硫代膽堿，與二硫代二硝基苯甲酸直接反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物5-硫代2-硝基苯甲酸，可觀察其特征吸收峰以確定濃度。Ellman 法操作簡單、成本低廉、分析快速，在諸如AChE 檢測、抑制劑篩選等研究中得到了廣泛應(yīng)用[2]。

1.2 基于TMB 的比色法

在類過氧化物納米酶的催化下，3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）可被氧化為藍(lán)色oxTMB，是一種常見比色體系。ZHANG 等[3]構(gòu)建了Ag+/金納米粒（AuNPs）/十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）類過氧化物納米酶，并基于該體系實現(xiàn)了AChE 的高靈敏檢測。LI 等[4]構(gòu)建了普魯士藍(lán)納米粒/共價有機(jī)骨架/AuNPs 復(fù)合納米材料，該材料具有優(yōu)異的類過氧化物酶活性，在體系存在乙酰硫代膽堿時，AChE 與其反應(yīng)生成硫代膽堿并干擾納米酶活性，進(jìn)而實現(xiàn)對AChE 的測量，該方法具有高度的特異性和高靈敏度。上述體系通常需要過氧化氫參與反應(yīng)，增加了操作步驟。NI 等[5]另辟蹊徑，開發(fā)出了基于銀離子和乙酰硫代膽堿碘化物的AChE 檢測系統(tǒng)，利用其降解產(chǎn)物硫代膽堿與銀離子的反應(yīng)減少oxTMB 生成實現(xiàn)了AChE 的檢測，該體系無需制備納米材料，為AChE 的比色檢測提供了新思路。

2 熒光法

熒光分析法具有優(yōu)異的生物相容性、高特異性和高靈敏度，是研究生物分子特性的理想工具。熒光法測定AChE 可分為熒光增強(qiáng)和熒光猝滅兩大類，通過觀測熒光信號turn on/off 實現(xiàn)對AChE 含量的監(jiān)測。

2.1 基于turn on 的方法

2.1.1 貴金屬納米探針

AChE 對乙酰硫代膽堿（ATCh）的水解具有高催化活性，可在數(shù)秒內(nèi)生成大量硫代膽堿（TCh）。張楠等[6]利用聚T 單鏈DNA 為模板合成了熒光銅納米粒子，通過TCh 與銅離子的絡(luò)合實現(xiàn)對AChE 活性的檢測和抑制劑的篩選。ZHANG 等[7]利用低熒光谷胱甘肽包封金納米團(tuán)簇（GSH-AuNCs），建立了一種直接熒光啟動法，AChE 水解S-乙酰基硫代膽堿碘化物（ATCI）得到TCh，水解產(chǎn)物可通過形成Au-S 鍵增強(qiáng)GSH-AuNCs 的熒光。在抑制劑存在的條件下，AChE 活性被抑制，熒光增強(qiáng)減弱。

2.1.2 雙光子熒光探針

相比單光子熒光成像，雙光子熒光成像技術(shù)組織穿透更深，背景干擾更低，更適用于活體成像。WANG 等[8]設(shè)計了一種雙光子熒光探針用于原位檢測小鼠大腦中的AChE 活性，該探針在800 nm 處通過雙光子激發(fā)，在560 nm 處發(fā)出明亮的熒光，具有極高的靈敏度和良好的選擇性。

2.1.3 近紅外熒光探針

傳統(tǒng)熒光探針受生物體背景熒光干擾，不利于組織成像。近紅外探針利用其較大的Stokes 位移可以實現(xiàn)深層組織穿透成像，具有更好的生物成像能力，光毒性也更低。FORTIBUI 等[9]使用BODIPY 染料作為熒光發(fā)射基團(tuán)，與AChE 結(jié)合時僅顯示微弱熒光，但當(dāng)體系中存在氨基甲酸二甲酯基團(tuán)時，活性結(jié)合位點絲氨酸失活，使BODIPY 轉(zhuǎn)為游離態(tài)，熒光增強(qiáng)。

2.1.4 金屬有機(jī)骨架探針

金屬有機(jī)骨架因比表面積大、生物相容性好等優(yōu)點成為新型納米酶的理想候選材料。H39GFP 是一種綠色熒光蛋白變體，主序列中含有39 個組氨酸殘基。LEI 等[10]基于H39GFP 獨特的多價金屬離子結(jié)合特性和Cu2+的電子轉(zhuǎn)移熒光猝滅效應(yīng)，研制了一種無標(biāo)記Cu2+熒光傳感器，可在5 min 內(nèi)快速檢測出Cu2+。以ATCh 為底物，進(jìn)一步將該H39GFP/Cu2+配合物基傳感器應(yīng)用于AChE 活性的turn on 熒光檢測。

2.1.5 硅量子點探針

SONG 等[11]采用硅量子點（Silicon Quantum Dots，Si-QDs）作為熒光振子，納米氧化鐵作為猝滅劑，測定AChE。在AChE 及其底物ATCh 存在下，F(xiàn)eOOH被酶解物TCh 分解，恢復(fù)Si-QDs 的熒光。特別的是，AChE 傳感的靈敏度與FeOOH 的晶體形態(tài)密切相關(guān)，采用α 型FeOOH 作為猝滅劑時靈敏度最高。

2.2 基于turn off的方法

2.2.1 金納米團(tuán)簇

MATHEW 等[12]利用牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）包覆金納米團(tuán)簇開發(fā)了一種高選擇性AChE 熒光檢測探針（AuQC@BSA）。AuQC@BSA 與AChE 結(jié)合后形成AuQC@BSA-AChE 復(fù)合物，AChE可以將ACh 水解為膽堿，進(jìn)而與AuQC@BSA-AChE相互作用并猝滅其熒光，最終實現(xiàn)目標(biāo)物檢測。

2.2.2 比率熒光探針

為改善單一熒光信號測定易受探針濃度、檢測儀器和操作誤差以及環(huán)境因素干擾的不足，XU 等[13]研制了一種基于碳點（Carbon Dots，CDs）的比率熒光探針。當(dāng)體系中的鄰苯二胺（OPD）被Cu2+氧化時，產(chǎn)物可有效猝滅CDs 藍(lán)色熒光，并在570 nm 處產(chǎn)生一個新的發(fā)射峰，形成一對比率熒光體系。AChE催化乙酰硫膽堿水解生成硫代膽堿，其巰基可捕獲Cu2+，抑制OPD 氧化，降低了CDs 被猝滅的程度。該探針對AChE 檢測限為0.10 U/L。

MnO2納米片因比表面積大、生物相容性好、氧化還原性能好、吸收帶寬（300 ～600 nm）、具過氧化物酶樣活性等特點常被應(yīng)用于熒光檢測體系。YE 等[14]利用石墨烯量子點（Graphene Quantum Dots，GQDs）和OPD，設(shè)計了一種高靈敏度、高選擇性檢測AChE的比率熒光探針。GQDs 具有強(qiáng)熒光，由于MnO2納米片的吸收光譜與GQDs 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間有廣泛重疊，GQDs 在450 nm 處的熒光被內(nèi)濾效應(yīng)有效猝滅。同時，由于MnO2納米片的過氧化物酶樣活性，OPD 被催化氧化為黃色熒光物質(zhì)2,3-二氨基酚嗪（oxOPD），在572 nm 處有一個新的發(fā)射峰，以熒光強(qiáng)度比F450/F572 作為信號輸出，可建立比率熒光法檢測AChE 活性。

表1 比色法與熒光法的比較

3 結(jié)語

作為AChE 最常見的兩種含量檢測方法，比色法和熒光法各有優(yōu)勢，一般而言熒光法的檢測限較低，線性范圍較廣，而比色法的操作更簡便，檢測成本更低。盡管如此，現(xiàn)有AChE 檢測方法的靈敏度仍有待提高，選擇性也亟待改善，且大都需要特定檢測設(shè)備。如何發(fā)展出高效率低成本的快速檢測方法，仍然是乙酰膽堿酯酶測定方法優(yōu)化的主要方向。