納豆激酶高產菌株的選育及其酶學活性研究

陳俊煌

（福建匯盛生物科技有限公司，福建漳州 363099）

納豆激酶是一種含有275 個氨基酸、分子量為27 728 Da 的蛋白酶，具有溶血、抗血小板凝集、溶栓等多種活性特點，有助于預防高血壓及動脈硬化[1]。納豆激酶除了在預防、治療心血管疾病方面有重要作用，相較于其他類別藥物，具備更多的優點，如發酵生產成本低、食用安全、無過敏源性、有靜脈注射或口服供選擇等，在腸道中保持較強的穩定性。因此，納豆激酶被認為是21 世紀口服溶血栓最具潛力的生物藥物[2-3]。但在現有報道中納豆激酶液體發酵酶活相對較低且酶活不穩定，制約了工業化大規模生產。

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），是一類有益于人體生命健康的安全菌株，是一種在食品發酵、酶制劑及藥品原料生產領域得到廣泛應用的優良菌株[4-5]。周雪琴等[6]從鮮納豆中分離篩選出一株枯草芽孢桿菌，優化發酵條件后生產出的納豆激酶酶活可達393.09 U/mL。陳曉飛等[2]以保藏的固體發酵產納豆激酶（NK）高活性菌株作為出發菌株，經紫外-亞硝基胍-60Co 復合誘變后，獲得發酵產NK 高活性的菌株，活性最高為2 184.32 U/mL，是誘變前出發菌株的1.98 倍。

本文從豆制品廢液沉淀池獲取泥沙樣，再經搖瓶液體發酵，纖維蛋白-瓊脂糖平皿點樣篩選，最終將溶解圈大、酶活性高的菌種分離出來，并從形態學、分子生物學以及酶學性質等方面對菌株進行鑒別和研究，旨在篩選出一株酶活高、性能穩定的納豆激酶菌株，為降血栓藥物、保健食品開發提供優良菌株資源和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

采集自豆制品廢液沉淀池的淤泥樣品。

1.1.2 培養基

（1）平皿培養基為LB 基礎培養基+2%瓊脂；（2）種子培養基為LB 基礎培養基；（3）發酵培養基成分為2%可溶性淀粉+1%胰蛋白胨+0.5%酵母粉+0.1% KH2PO3+0.2% K2HPO3·3H2O+0.02% CaCl2。

1.1.3 儀器與試劑

PH50-3A43L-A 生物顯微鏡，鳳凰光學股份有限公司；XD-202 倒置顯微鏡，南京江南永新光學有限公司；TGL-16 醫用離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；PAX-150B 生化培養箱，寧波賽福實驗儀器有限公司。

纖維蛋白原、凝血酶、尿激酶，中國食品藥品檢定研究院。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化

樣品采用稀釋涂布法，37 ℃培養1 ～2 d。選取長勢良好、形態單一、類似芽孢菌的單菌落，連續純化3 次即可分離出純培養單菌落。

1.2.2 菌株的鑒定

（1）形態學觀察。根據相關文獻，觀察菌株的菌落形態、革蘭氏染色及其芽孢染色[7-8]。

（2）分子生物學鑒定。使用DNA 提取試劑盒提取菌株DB-07 DNA，然后進行PCR 反應及跑膠，得到一條清晰、明亮的條帶，送廈門鉑瑞生物公司測序。BLAST 序列比對，并進行系統發育進化樹的構建。

1.2.3 纖維蛋白-瓊脂糖測定平皿的制備

取已滅菌的1.5%瓊脂糖溶液10 mL 至燒杯中，50 ℃水浴，另外吸取10 mL 纖維蛋白原溶液（1.5 mg/mL）、760 μL 凝血酶溶液（1 bp/mL）分別在50 ℃水浴保溫20 min。將上述藥品混合均勻，無菌倒板，靜置30 min 后置4 ℃冰箱保存。

1.2.4 粗酶液的制備

菌株接種發酵，37 ℃、150 r/min 培養48 h。離心收集上清，即得粗酶液。

1.2.5 酶活測定

1.2.5.1 尿激酶標準曲線的繪制

用0.9%氯化鈉溶液對1000 IU/mL 尿激酶母液進行梯度稀釋配制，得20 IU/mL、40 IU/mL、60 IU/mL、80 IU/mL、100 IU/mL 樣品溶液。分別吸取5 μL 各濃度的尿激酶溶液在纖維蛋白-瓊脂糖平皿2mm 孔中點樣，然后正放于生化培養箱30 ℃培養16 h。X軸表示溶解圈面積，Y 軸表示尿激酶濃度，繪制標準曲線。

1.2.5.2 納豆激酶酶活的測定

納豆激酶的酶活以尿激酶活力（IU/mL）來定義。發酵液12 000 r/min 離心10 min，收集上清，生理鹽水稀釋50 倍，取5 μL 生理鹽水稀釋后的酶液在纖維蛋白-瓊脂糖平皿上點樣，正放置于生化培養箱30 ℃培養16 h，根據上述標準曲線測酶活。

1.2.6 納豆激酶酶學活性研究

1.2.6.1 最適反應溫度

在8 支5 mL 離心管中各加入500 μL 稀釋至一定酶活的納豆激酶溶液，在pH 自然條件下水浴30 min，研究20 ～55 ℃條件對納豆激酶活性的影響，水浴結束立即放置冰浴10 min，平皿點樣測定酶活，以最高酶活為100%進行組間比較。

1.2.6.2 最適反應pH

配制pH 分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的酶液，在30 ℃條件下水浴30 min，水浴結束立即放置冰浴10 min，之后在平皿點樣，以最高酶活為100%進行組間比較。

1.2.6.3 最適水浴時間

在最適反應溫度和pH 條件下，水浴時間分別設置 為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，水浴結束后冰浴10 min，平皿點樣，以最高酶活為100%進行組間比較。

1.2.6.4 不同金屬離子對納豆激酶酶學活性的影響

根據文獻[1]設定金屬離子濃度為10 mmol/L，在最適的溫度、pH 及水浴時間條件下，研究Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Fe2+對納豆激酶酶活的影響。以不添加金屬離子時的最高酶活為100%，進行組間比較。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

經過分離純化獲得的菌株，接種至搖瓶發酵培養48 h，發酵液離心收集上清液，在纖維蛋白-瓊脂糖平皿中點樣測定納豆激酶酶活。比較菌株之間透明圈直徑大小，選擇透明圈直徑大的菌株繼續復篩，選育到一株芽孢桿菌，搖瓶酶活水平為3 097.63 IU/mL，編號DB-07。菌株DB-07 納豆激酶溶解圈見圖1（箭頭所指部位）。

圖1 納豆激酶平皿溶解圈

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態學觀察

如圖2 所示，菌株DB-07 在LB 平皿培養基中培養24 h，菌落形狀不規則、白色、表面粗糙、無光澤、不透明、質地蠟狀、扁平、邊緣波狀；該菌為G+，菌體短桿狀；芽孢染色呈綠色、菌體呈紅色，芽孢中生、短橢圓形。根據以上結果，初步判定DB-07 菌株歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 菌株DB-07 形態特征

2.2.2 分子生物學鑒定

菌株DB-07 的16S rRNA 序列長度為1 459 bp，序列比對結果與B.subtilis有99.79%相似度，序列覆蓋度為98%，系統發育進化樹結果顯示菌株DB-07與B.subtilis在同一分支上（圖3）。因此，將菌株DB-07 鑒定為B.subtilis。

圖3 DB-07 菌株的系統發育樹

2.3 納豆激酶活力測定

2.3.1 納豆激酶酶活標準曲線

以尿激酶為標準品，制備納豆激酶酶活標準曲線，見圖4。

圖4 納豆激酶酶活標準曲線

2.3.2 納豆激酶酶活的測定

測量溶解圈直徑為4.17 mm，得到溶解圈面積為54.60 mm2，代入公式，計算出納豆激酶的酶活為3 097.63 IU/mL。

2.4 菌株DB-07 的納豆激酶酶學活性研究

2.4.1 菌株DB-07 的納豆激酶最適溫度

如圖5 所示，隨著溫度的上升，納豆激酶酶活呈現先升后降的趨勢，溫度30 ℃時酶活最高。隨著溫度的繼續上升，酶活逐漸下降，說明高溫環境不利于納豆激酶酶活性質穩定。因此，菌株DB-07 的納豆激酶的最適反應溫度確定為30 ℃。

圖5 溫度對納豆激酶酶學活性的影響

2.4.2 菌株DB-07 的納豆激酶最適pH

如圖6 所示，隨著pH 值上升，酶活先升后降。當pH 值為6.5 時，納豆激酶酶活達到最大值；pH 低于5.0 時，酶活快速降低，說明低pH 值不利于酶學活性的維持。因此，菌株DB-07 的納豆激酶最適反應pH 確定為6.5。

圖6 pH 對納豆激酶酶學活性的影響

2.4.3 菌株DB-07 的納豆激酶最適水浴時間

如圖7 所示，隨著水浴保溫時間的增加，酶活先升后降，然后逐漸維持一定范圍的酶學活性。水浴60 min 時酶活最高；從60 min 增加到90 min，相對酶活下降近30%，90 min 之后酶活逐漸穩定。從實驗結果分析，在水浴保溫時間相對較短情況下，對納豆激酶能夠起到激發酶學活性的作用，隨著時間延長，酶活逐漸下降。因此，菌株DB-07 的納豆激酶最適反應水浴時間確定為60 min。

圖7 水浴時間對納豆激酶酶學活性的影響

2.4.4 不同金屬離子對菌株DB-07 納豆激酶酶學活性的影響

如表1 所示，Ca2+和Cu2+能夠提高菌株DB-07納豆激酶的酶學活性，而Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+則會抑制納豆激酶的酶學活性。因此，在應用中應避免體系中存在游離的Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+，可適當加入Ca2+和Cu2+。

表1 金屬離子對納豆激酶酶學活性的影響

3 結論

本研究從豆制品廢液沉淀池的淤泥樣品中分離篩選到一株產納豆激酶菌株DB-07，該菌株發酵上清液在纖維蛋白-瓊脂糖平皿培養后具有明顯的溶解透明圈。經菌落形態學和分子生物學鑒定，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。

枯草芽孢桿菌DB-07 在搖瓶中37 ℃、150 r/min培養48 h，納豆激酶酶活力達到3 097.63 IU/mL。納豆激酶在溫度30 ℃、pH 值6.5、水浴時間60 min 條件下，能夠保持較高的活性，Ca2+和Cu2+能夠提高納豆激酶的酶學活性，而Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+則會抑制納豆激酶的酶學活性。本研究獲得的菌株DB-07 是一株能夠高產納豆激酶的枯草芽孢桿菌，可為降血栓藥物、保健食品的開發提供優良的菌株資源。