超聲輻照對載鹽霉素鈉納米氣泡的藥物釋放作用

徐君君,孫碧云,凌 茜,彭 煒,江 峰

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 超聲醫(yī)學(xué)科,安徽 蕪湖 241001)

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1],目前臨床常用的主要治療方法多為手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療,這些治療方案具有較強(qiáng)的全身性副作用。高強(qiáng)度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound,HIFU)已被用于病理病變的熱消融,通過細(xì)胞膜上孔的瞬時形成進(jìn)行局部微創(chuàng)超聲介導(dǎo)的藥物遞送,皮膚和血腦屏障的暫時破壞,超聲波誘導(dǎo)血栓分解,以及使用超聲波和溫度敏感藥物載體有針對性地釋放藥物[2]。鹽霉素通過抑制Nrf2信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而觸發(fā)前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡[3]。鹽霉素鈉是鹽霉素的鈉鹽形式,價格低于鹽霉素,鹽霉素鈉和鹽霉素對乳腺癌的殺傷作用未出現(xiàn)明顯差異[4]。脂質(zhì)納米顆粒是一個多功能的遞送平臺,克服了基因治療的主要障礙,即核酸降解和有限的細(xì)胞攝取[5]。Qian等研制的靶向于神經(jīng)肽Y1受體的納米氣泡對乳腺癌具有靶向作用,增強(qiáng)滯留效應(yīng)[6]。本研究旨在觀察超聲波輻照能否增加載鹽霉素鈉納米氣泡中藥物的釋放,為腫瘤疾病的精準(zhǔn)治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 空白脂質(zhì)體納米氣泡的制備 以一定比例稱取二苯基磷酰基疊氮化物、二硬脂酰磷脂酰膽堿、生物素化二硬脂磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇,加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的茄形瓶中,再加入2∶1氯仿/甲醇,混合后旋蒸為均勻薄膜樣。用10 mL PBS緩沖液,使薄膜樣物質(zhì)充分溶解于緩沖液中。向溶液瓶充入六氟化硫(SF6)氣體,隨后用銀汞調(diào)和器振蕩90 s,并通過0.22 μm過濾器,得到的即為空白脂質(zhì)體納米氣泡,置于4℃冰箱保存。重新稱量上述3種試劑,同時向茄形瓶中加入一定量鹽霉素鈉,余過程與上述實驗類似,得到載鹽霉素鈉納米氣泡,4℃冰箱保存。

1.2 脂質(zhì)體的表征 采用倒置顯微鏡和透射電子顯微鏡(TEM)觀察兩種脂質(zhì)體納米氣泡的形態(tài)。采用納米顆粒跟蹤分析儀測量納米氣泡粒徑大小,檢測兩種納米氣泡的濃度。

1.3 PC3細(xì)胞培養(yǎng) PC3細(xì)胞購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司,培養(yǎng)基為89% F-12K培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液,放置在pH 7.2～7.4、溫度37℃、濕度95%、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 CCK-8實驗 每組5個復(fù)孔,細(xì)胞懸液量為100 μL/孔,100 μL懸液中約2 000個細(xì)胞,接種4塊同樣的96孔板,將4塊培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

接種細(xì)胞懸液的培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后,向6孔板其中4個孔中分別加入3 mL細(xì)菌過濾器過濾后的載藥納米氣泡,4個孔分別對應(yīng)1.0、1.5、2.0、2.5 W/cm24個超聲輻照強(qiáng)度。調(diào)整超聲治療儀強(qiáng)度為1.0 W/cm2,將6孔板底部均勻涂上超聲耦合劑,超聲治療儀探頭緊貼6孔板底部,分別照射0、5、10、15、20、25 s。分別取照射0、5、10、15、20、25 s后的載藥納泡加入96孔板對應(yīng)的分組,每孔加入100 μL納米氣泡。調(diào)整超聲治療儀輻照強(qiáng)度為1.5、2.0、2.5 W/cm2,用同樣的方法將載藥納米氣泡加入另外3塊96孔板,將輻照后的4塊96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,向每孔中加入10 μL CCK-8試劑,避光操作。加入CCK-8試劑2 h后,設(shè)置酶標(biāo)檢測儀波長為450 nm,測量此波長下細(xì)胞的吸光度(OD)值。根據(jù)OD值,得到不同輻照強(qiáng)度和時間細(xì)胞的活力改變,每組OD值去除最大和最小值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 PC3細(xì)胞生長狀態(tài)良好 前列腺癌PC3細(xì)胞為梭形、貼壁生長細(xì)胞,光學(xué)顯微鏡下可觀察PC3細(xì)胞形態(tài)為梭形,生長情況良好,細(xì)胞均質(zhì)而透明,折光性良好,培養(yǎng)基清亮透明,鏡下可見細(xì)胞背景干凈清晰,提示PC3細(xì)胞生長狀態(tài)佳(圖1)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察PC3細(xì)胞的生長情況(×100)

2.2 顯微鏡下觀察兩種納米氣泡 光學(xué)顯微鏡下觀察,可見兩種納米氣泡呈圓形,大小一致,形態(tài)良好(圖2A、B)。透射電子顯微鏡下空白納米氣泡(圖2C)呈圓形,大小均一;載藥納米氣泡內(nèi)可見分散均勻的黑色顆粒狀物質(zhì),考慮為攜帶的鹽霉素鈉顆粒(圖2D)。

A.顯微鏡下觀察空白納米氣泡(×400);B.顯微鏡下觀察載藥納米氣泡(×400);C.透射電鏡下觀察空白納米氣泡(200 nm);D.透射電鏡下觀察載藥納米氣泡(200 nm)。

2.3 兩種納米氣泡粒徑大小和濃度的測定 結(jié)果顯示,兩種納米氣泡第0天～第14天測得的粒徑大小差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 兩種納米氣泡隨時間改變氣泡粒徑大小變化情況 nm

2.4 光學(xué)顯微鏡下觀察不同超聲輻照強(qiáng)度照射后釋放的鹽霉素鈉對前列腺癌PC3細(xì)胞的改變 光學(xué)顯微鏡下觀察,同一輻照時間,隨著輻照強(qiáng)度的增加,可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。相比于輻照過的載藥納米氣泡,未輻照過的載藥納泡對細(xì)胞活力的影響較小(圖3)。

A.對照組(×200);B.1.0 W/cm2輻照5 s組(×200);C.1.5 W/cm2輻照5 s組(×200);D.2.0 W/cm2輻照5 s組(×200);E.2.5 W/cm2輻照5 s組(×200)。

2.5 超聲輻照后細(xì)胞活力變化 同一輻照強(qiáng)度下,與0 s相比,OD值均下降(P<0.05);輻照強(qiáng)度1.5 W/cm2時,10 s與5 s相比,OD值下降(P<0.05);輻照強(qiáng)度2.0 W/cm2時,15 s與10 s相比,OD值下降(P<0.05)。同一輻照時間(5～25 s),與2.5 W/cm2相比,OD值均升高(P<0.05)。輻照時間為10、20、25 s時,1.5 W/cm2與1.0 W/cm2相比,OD值均下降(P<0.05);輻照時間為25 s時,2.0 W/cm2與1.5 W/cm2相比,OD值下降(P<0.05)。見表2。

表2 不同時間和不同強(qiáng)度超聲輻照下釋放的鹽霉素鈉對細(xì)胞的殺傷作用(OD值)

3 討論

近年來納米技術(shù)快速發(fā)展,有研究證實制備靶向于目標(biāo)疾病的納米氣泡,在目標(biāo)部位予以超聲輻照可以觸發(fā)惰性氣體產(chǎn)生微氣泡,引起超聲空化效應(yīng);與此同時合適的超聲輻照強(qiáng)度和輻照時間還能促進(jìn)包裹藥物的納米氣泡定向釋放攜帶的藥物,達(dá)到定向治療的作用[7-8]。

鹽霉素為脂溶性物質(zhì),不溶于水,限制了其在研究和臨床中的應(yīng)用。鹽霉素鈉是鹽霉素的鈉鹽形式,具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì),但市場價格鹽霉素鈉明顯低于鹽霉素,有研究證實,對于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7,鹽霉素鈉和鹽霉素具有相似的抑制作用[4]。本研究將鹽霉素鈉載入脂質(zhì)體納米氣泡中,有利于脂溶性藥物對細(xì)胞產(chǎn)生作用,開拓了脂溶性藥物在研究中的應(yīng)用。有研究團(tuán)隊研發(fā)了鹽霉素納米晶體,與游離鹽霉素相比,鹽霉素納米晶體提高了細(xì)胞攝取效率[9]。有研究檢測了前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和非惡性前列腺細(xì)胞株RWPE-1的細(xì)胞活力,鹽霉素處理后,兩種細(xì)胞系的細(xì)胞活力呈劑量和時間依賴性下降[10-13]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)輻照后釋放的鹽霉素鈉對前列腺癌PC3細(xì)胞具有殺傷作用,輻照強(qiáng)度和輻照時間不同,釋放出的鹽霉素鈉含量不同。隨著研究方法和方式的進(jìn)步以及社會的需要,鹽霉素的潛在功能還有待發(fā)掘。

超聲波體外控制藥物的釋放,可以提高藥物的利用率,減少藥物的毒副作用[14]。近年有研究通過編程構(gòu)建低強(qiáng)度超聲聚焦超聲觸發(fā)相變遞送阿霉素納米系統(tǒng),以顯著增強(qiáng)抗癌藥物遞送[15]。本研究成功制備空白納米氣泡和載鹽霉素鈉納米氣泡,兩種納米氣泡粒徑大小隨時間改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義,納米氣泡狀態(tài)較穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)納米氣泡釋放的鹽霉素鈉量與超聲輻照干預(yù)的時間及輻照強(qiáng)度相關(guān),隨著輻照時間與強(qiáng)度的改變,釋放的鹽霉素鈉量發(fā)生改變。同一輻照時間下,輻照強(qiáng)度2.5 W/cm2時,釋放的鹽霉素鈉的量較輻照強(qiáng)度1.0 W/cm2、1.5 W/cm2、2.0 W/cm2更多;同一輻照強(qiáng)度,輻照時間為5 s時釋放的鹽霉素鈉量與未輻照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。輻照強(qiáng)度和時間的增加會對正常組織產(chǎn)生損傷作用[16],我們在實驗過程中應(yīng)該選用合適的輻照時間和輻照強(qiáng)度,在有效治療腫瘤的同時,減少對正常細(xì)胞組織的殺傷作用。結(jié)果表明超聲輻照可以幫助載鹽霉素鈉納米氣泡中鹽霉素鈉的釋放,為前列腺癌的精準(zhǔn)治療提供了思路和方法。

本研究發(fā)現(xiàn)在超聲輻照下載鹽霉素鈉納米氣泡釋放出鹽霉素鈉,釋放出的鹽霉素鈉對前列腺癌PC3細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。同時,本研究也存在不足之處,探究釋放的負(fù)載藥物對癌細(xì)胞的殺傷作用時,應(yīng)檢測單純超聲輻照對癌細(xì)胞的作用,確定超聲對正常組織和細(xì)胞作用較小的輻照強(qiáng)度和時間。合適的輻照時間和強(qiáng)度在對藥物進(jìn)行釋放的同時,也能減少輻照對周圍正常組織和細(xì)胞的損傷,因此合適的超聲輻照強(qiáng)度和時間對癌細(xì)胞以及正常組織細(xì)胞的作用還需要進(jìn)一步研究。有研究證實,STEAP-1抗體可以靶向于前列腺癌PC3細(xì)胞[17],納米氣泡攜帶特異性抗體,并依靠抗原-抗體之間的特異性結(jié)合方式,將特異性抗體連接到納泡表面,通過血液循環(huán)特異地積聚到靶器官或靶組織,應(yīng)用實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng),達(dá)到靶向給藥的作用。能否制備出靶向載藥納米氣泡,并探究靶向和超聲輻照共同作用下提高目標(biāo)部位的藥物濃度,減少對其他組織器官的藥物副作用,也需要進(jìn)一步研究。納米顆粒在藥物遞送和靶向治療方面的研究,以及超聲輻照在納米氣泡液-氣相轉(zhuǎn)變方面的作用,不僅給癌癥患者帶來治療希望,也對其他疾病的治療提供了方法和思路。