萊茵衣藻IFT20 的原核表達、純化及多克隆抗體鑒定

賈瑞勤， 賈 航， 鄭學超， 薛 斌，3， 樊振川*，3

（1.天津科技大學 食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；3.天津科技大學 大健康生物技術(shù)國家國際科技合作基地，天津 300457）

鞭毛是一種存在于大多數(shù)真核細胞表面的具有運動、感知和信號傳導功能的細胞器。 鞭毛由鞭毛軸絲、基體和鞭毛膜組成。 根據(jù)鞭毛軸絲結(jié)構(gòu)不同，將鞭毛分為9+2 型運動纖毛（motile cilia）和9+0型原發(fā)性纖毛（primary cilia）2 種類型[1]。由于鞭毛不具有蛋白質(zhì)合成所需的細胞器（如核糖體等），因此鞭毛生成和維持所需的前體蛋白質(zhì)和降解產(chǎn)物均需通過鞭毛內(nèi)運輸（intaflagellar transport，IFT）的方式輸入和輸出鞭毛[2]。 1993 年發(fā)現(xiàn)IFT 存在于萊茵衣藻鞭毛中，其顆粒沿著鞭毛軸絲進行雙向運輸[3]。IFT 顆粒從鞭毛基部到頂部的運輸稱之為正向運輸，這一過程由驅(qū)動蛋白-2（kinesin-2）驅(qū)動[4]；反之則稱之為反向運輸，由動力蛋白-1b（dynein-1b）驅(qū)動[5]。 目前已知IFT 顆粒由IFT-A 和IFT-B 共2 個蛋白質(zhì)復合物組成，其中IFT-A 含有6 個蛋白質(zhì)亞基，通過與動力蛋白-1b 偶聯(lián)來調(diào)控IFT 反向運輸[6]。而IFT-B 則由16 個蛋白質(zhì)亞基組成， 通過與驅(qū)動蛋白-2 偶聯(lián)來調(diào)控IFT 正向運輸[7]。 此外，IFT-B 在生化功能關(guān)系上可進一步劃分為IFT-B1 和IFT-B2等2 個亞蛋白質(zhì)復合物[8-9]。 生化和遺傳實驗表明IFT 對維持鞭毛生成和信號傳導功能是必需的，鞭毛組裝缺陷或信號功能缺失可引發(fā)一系列統(tǒng)稱為纖毛病 （ciliopathy） 的先天性疾病， 其中就包括Bardet-Biedl 綜 合 征[10]、Joubert 綜 合 征[11]和Meckel綜合征[12]等。

IFT20 是IFT-B 的一個組成成分， 在具鞭毛生物中是高度進化保守的[13]。 研究表明，IFT20 蛋白缺失會導致小鼠視錐細胞鞭毛生物生成受阻，視紫紅質(zhì)無法運送到視錐細胞外節(jié)，導致其在細胞內(nèi)節(jié)大量堆積而引發(fā)神經(jīng)退行性病變[14-15]。 此外，IFT20 可以和精子鞭毛蛋白2（SPEF2）相互作用，影響正常的生精導致雄性不孕[16]。因此，研究IFT20 的鞭毛生物學功能及其異常表達引發(fā)相關(guān)疾病的分子機制對于預防、診斷和開發(fā)相關(guān)藥物治療這些疾病具有十分重要的意義。

萊茵衣藻是一種單細胞真核藻類，作為一種模式生物， 萊茵衣藻已被廣泛應(yīng)用于鞭毛內(nèi)運輸、組裝和功能的研究。 因此，作者擬制備高特異性的萊茵衣藻IFT20 蛋白多克隆抗體， 為后續(xù)開展IFT20在萊茵衣藻鞭毛內(nèi)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料大腸桿菌（Escherichia coli）表達載體pET-28a（+）和pMAL-c2x、大腸桿菌XL1-blue和BL21（DE3）菌株、萊茵衣藻野生型藻種CC-125：均為作者所在實驗室保存。

1.1.2 實驗試劑限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、RNase-M-MLV 酶、核酸和蛋白質(zhì)標準品以及TriZol等：北京全式金生物有限公司；IPTG、卡那霉素、氨芐青霉素、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒等：Sangon Biotech 公司； 質(zhì)粒提取試劑盒：TIANGEN 公司； 硝酸纖維素膜： 美國PALL 公司；Protein A SepharoseTMCL-4B、Ni SepharoseTM6 Fast Flow 和Dextrin SepharoseTMHigh Performance 等：美國GE Healthcare 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記二 抗： 美 國Jackson 公 司；ECL 發(fā) 光 液： 德 國Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 萊茵衣藻總RNA 提取野生型萊茵衣藻CC-125 細胞在-80 ℃凍存后置于研缽中，加入液氮將其研磨至粉末狀后轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中。 加入1 mL Trizol 和20 μL β-巰基乙醇后劇烈振蕩，并于室溫靜置10 min。 加入600 μL 氯仿-異戊醇（體積比24∶1），顛倒混勻后加入90 μL 無水乙醇，靜置2 min。 于10 000 r/min 冷凍離心15 min， 吸取上清液， 加入2 倍體積的無水乙醇和0.2 倍體積的醋酸鈉， 混勻后于-20 ℃靜置30 min， 接著于10 000 r/min 冷凍離心15 min。 棄上清液，加入2 mL 體積分數(shù)75%的乙醇， 充分混勻后于10 000 r/min 冷凍離心8 min。 棄上清液，在超凈工作臺中于室溫干燥5 min。 加入50 μL DEPC 水，吹勻溶解，測定所獲總RNA 濃度并驗證。 混勻5 μL DNA 酶緩沖液，2 μL DNA 酶，0.5 μL RNA 酶抑制劑和45 μL RNA 樣品，將其在37 ℃烘箱中30 min 以去除DNA。 最后用氯仿-異戊醇和水飽和酚抽提3 次， 最終獲得萊茵衣藻總RNA。

1.2.2 大腸桿菌表達載體pET-28a （+）-ift20 和pMAL-c2x-ift20 的構(gòu)建在Phytozome v12.1 數(shù)據(jù)庫中搜索ift20 基因cDNA 序列， 設(shè)計含有EcoR I酶切位點的上游引物IFT20-FOR 和含有Hind III酶切位點的下游引物IFT20-REV，見表1。以萊茵衣藻野生型藻種CC-125 總RNA 為模板進行反轉(zhuǎn)錄以生成cDNA， 并以此cDNA 為模板進行ift22 cDNA 擴增。 將ift22 cDNA 克隆至大腸桿菌表達載體pET-28a（+）和pMAL-c2x，所得重組表達載體命名為pET-28a（+）-ift20 和pMAL-c2x-ift20。

表1 IFT20 cDNA 擴增引物序列Table 1 Primers for the amplification of IFT20 cDNA

1.2.3 融合蛋白誘導表達將重組表達載體pET-28a（+）-ift20 和pMAL-c2x-ift20 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）細胞并將細菌涂布于LB 培養(yǎng)基平板。待轉(zhuǎn)化子形成后， 挑取單克隆細菌至LB 液體培養(yǎng)基，在37 ℃于220 r/min 培養(yǎng)過夜，而后將其以體積分數(shù)5%接種至LB 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。 當OD600達到0.8～1.0 時，加入0.2 mmol/L IPTG 誘導蛋白質(zhì)進行表達， 該過程在25 ℃、220 r/min 下進行6～8 h。 離心收集菌體后加入結(jié)合緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.4， 應(yīng) 用于pET-28a（+）-ift20 體系；20 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、pH 7.4， 應(yīng)用于pMAL-c2xift20 體系），重懸菌體并進行超聲破碎，對細菌破碎物進行SDS-PAGE 電泳分析，分析融合蛋白質(zhì)是否存在于上清液中。 在融合蛋白質(zhì)誘導表達過程中，所有培養(yǎng)基都需添加相應(yīng)抗生素。

1.2.4 融合蛋白質(zhì)純化重懸含有pET-28a（+）-ift20 和pMAL-c2x-ift20 的菌體于上述結(jié)合緩沖液中， 超聲破碎菌體后將上清液 （重組蛋白6×His：：IFT20 和MBP：：IFT20 均溶于上清液中）與1 mL Ni SepharoseTM6 Fast Flow （結(jié) 合6×His：：IFT20）或Dextrin Sepharose TM High Performance （ 結(jié) 合MBP：：IFT20）填料混勻，4 ℃過夜。 用結(jié)合緩沖液漂洗填料10 次， 后用洗脫緩沖液 （50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪 唑，pH 7.4 或20 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L 麥 芽 糖，pH 7.4） 分 別 針 對6×His：：IFT20 和MBP：：IFT20 進行洗脫， 收集重組蛋白質(zhì)并對其進行SDS-PAGE 電泳分析。

1.2.5 動物免疫將6×His：：IFT20 蛋白抗原（純度大于85%） 送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司，選擇新西蘭大白兔為免疫動物進行抗血清生成。

1.2.6 抗血清效價檢測抗血清效價檢測按文獻[17]的間接ELISA 法進行。 具體而言，將IFT20 包被抗原稀釋至10 μg/mL， 并以100 μL/孔包被于酶標板。 用體積分數(shù)5%的脫脂牛奶封閉液對抗原室溫封閉1 h 后棄去。 用PBST 清洗液洗板3 次，加入抗血清室溫孵育1 h。 孵育結(jié)束后，用PBST 清洗液洗板4 次，加入酶標二抗室溫孵育30 min。 最后加入TMB（3’，3’，5’，5’-四甲基聯(lián)苯胺）溶液顯色，利用酶標儀測定其在OD450處的吸光值， 效價定義為最大OD 值一半時所對應(yīng)的抗血清稀釋倍數(shù)。

1.2.7 IgG 亞型抗體富集IgG 亞型抗體富集參照文獻[18]的方法。 取一定量的抗血清和結(jié)合緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、pH 7.0）混勻，將其轉(zhuǎn)入裝有Protein A 純化珠的純化柱中， 室溫結(jié)合1～2 h 后，用結(jié)合緩沖液漂洗3 次。 最后用酸性洗脫液（0.1 mol/L Glycine，pH 3.0）洗脫，中和后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 抗原抗體親和純化抗原抗體親和純化參照文獻[19]的方法。 用1 mmol/L HCl 溶脹CNBractivated Sepharose 4B 干粉， 并用結(jié)合緩沖液（0.1 mol/L NaHCO3、500 mmol/L NaCl、pH 8.3） 將其pH值調(diào)至8.3。 將MBP：：IFT20 蛋白抗原溶于結(jié)合液中，與溶脹好的CNBr-activated Sepharose 4B 于4 ℃過夜。 離心后在0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液中室溫靜置2～4 h。 最后用100 mmol/L Tris-HCl 和0.5 mol/L NaCl 洗脫液（pH 8.5）與50 mmol/L 甘氨酸和1 mol/L NaCl 洗脫液（pH 3.5）交替洗脫至少8次。 將偶聯(lián)抗原的CNBr-activated Sepharose 4B 與經(jīng)Protein A 富集后的抗體孵育，按照以上IgG 亞型抗體富集的方法洗脫抗體，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9 免疫印跡檢測免疫印跡檢測參照文獻[20]的方法進行。 取20 μg 萊茵衣藻野生型藻種CC-125 的全細胞蛋白質(zhì)提取物進行SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束后將分離好的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜， 并利用體積分數(shù)5%的脫脂牛奶封閉液對其進行封閉， 添加稀釋后的純化抗體室溫孵育1 h，用TBST 漂洗液 （10 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，體積分數(shù)0.05% Tween-20，pH 7.5）漂洗3 次。 最后加入二抗室溫孵育1 h， 用TBST 對其漂洗3 次后，用ECL 化學發(fā)光顯色液曝光。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌表達載體pET-28a（+）-ift20 構(gòu)建

以萊茵衣藻野生型藻種CC-125 總RNA 生成所得cDNA 為模板，利用表1 中所示上下游引物進行PCR 擴增， 獲得大小為400 bp 左右的PCR 產(chǎn)物。 該cDNA 擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoR I 和Hind III 雙酶切后克隆至大腸桿菌表達載體pET-28a（+），將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL1-blue 感受態(tài)細胞， 隨機挑取2 個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進行酶切驗證，見圖1。結(jié)果表明，EcoR I 和Hind III 雙酶切可以切出與載體和目的基因大小相符的2 個片段。 將酶切驗證正確的質(zhì)粒測序分析后命名為pET-28a（+）-ift20。

圖1 重組質(zhì)粒pET-28a（+）-ift20 的EcoR I 和Hind III雙酶切驗證Fig.1 Double restriction digestion verification of the recombinant plasmid pET-28a（+）-ift20 by EcoR I and Hind III

2.2 6×His：：IFT20 重組蛋白誘導表達及純化

將重組表達載體pET-28a（+）-ift20 轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BL21（DE3），誘導表達融合蛋白6×His：：IFT20。 將融合蛋白6×His：：IFT20 進行鎳柱親和純化，而后對純化產(chǎn)物進行SDS-PAGE 電泳分析。 如圖2 所示，6×His：：IFT20 溶于菌體上清液中， 以可溶性蛋白質(zhì)的形式存在。 灰度量化分析表明，純化后的6×His：：IFT20 融合蛋白約占菌體上清液總蛋白質(zhì)的85%，符合免疫蛋白抗原純度不低于85%的要求。 收集大約2.5 μg 的6×His：：IFT20 融合蛋白用于免疫新西蘭大白兔。

圖2 SDS-PAGE 檢測6×His：：IFT20 融 合蛋白在大 腸桿菌BL21（DE3）中的表達及后續(xù)純化Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression of 6×His：：IFT20 fusion protein in E.coli BL21（DE3） and its subsequent purification

2.3 IFT20 抗血清效價檢測

將6×His：：IFT20 融合蛋白送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司免疫新西蘭大白兔3 次，取耳靜脈血進行間接ELISA 法抗血清效價檢測。 如圖3所示， 最大OD 值的一半數(shù)值處所對應(yīng)的抗血清稀釋倍數(shù)為102 400。 因此，所得IFT20 抗血清效價為1∶102 400。

圖3 間接ELISA 法測定IFT20 抗血清效價Fig.3 Determination of anti-IFT20 polyclonal antiserum titer by indirect ELISA

2.4 IFT20 抗體純化及其特異性檢測

2.4.1 IFT20 抗血清IgG 富集兔源抗血清中含有諸多抗體亞型， 為獲得高親和性抗IFT20 的IgG 亞型抗體，我們利用Protein A 純化珠對IFT20 抗血清IgG 進行了富集， 并對富集得到的IgG 進行了免疫印跡檢測。如圖4 所示，抗血清經(jīng)Protein A 富集后，可以識別萊茵衣藻野生型藻種CC-125 全細胞蛋白質(zhì)提取物中的內(nèi)源IFT20 蛋白質(zhì)，但多條非特異性蛋白質(zhì)條帶仍然可見，需要對其進一步親和純化以提高IFT20 抗體的特異性。

圖4 免疫印跡法檢測抗血清富集IgG 識別IFT20 的特異性Fig.4 Specificity of the antiserum -enriched IgG for recognizing IFT20 in immunoblotting assay

2.4.2 IFT20 抗體親和純化用EcoR I 和Hind III對pET-28a（+）-ift20 進行酶切獲得ift20 cDNA，并將其克隆至大腸桿菌表達載體pMAL-c2x。 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL1-blue 細胞中， 待平板長出轉(zhuǎn)化子后，隨機挑取2 個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進行酶切驗證。 如圖5 所示， 重組載體經(jīng)EcoR I 和Hind III雙酶切得到符合載體和目的基因大小的2 個片段，將測序驗證后的載體命名為pMAL-c2x-ift20。 將pMAL-c2x-ift20 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）細胞，誘導表達融合蛋白MBP：：IFT20 并進行親和純化。 如圖6 所示，MBP：：IFT20 融合蛋白為水溶性蛋白質(zhì)，親和純化所得MBP：：IFT20 純度約為93.5%。 按1.2.8 所述實驗方法，將純化后的MBP：：IFT20 融合蛋白與CNBr-activated Sepharose 4B 偶聯(lián)， 然后按照1.2.8 所述方法對抗IFT20 IgG 進行抗原抗體親和純化，收集純化后的抗體，保存?zhèn)溆谩?/p>

圖5 重組質(zhì)粒pMAL-c2x-ift20 的EcoR I 和Hind III 雙酶切驗證Fig.5 Double restriction digestion verification of the recombinant plasmid pMAL-c2x-ift20 by EcoR I and Hind III

圖6 SDS-PAGE 檢測MBP：：IFT20 融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達及后續(xù)純化Fig.6 SDS-PAGE analysis of the expression of MBP：：IFT20 fusion protein in E.coli BL21（DE3） and its subsequent purification

2.4.3 IFT20 抗體免疫印跡特異性檢測將純化后的IFT20 抗體稀釋500 倍，對萊茵衣藻野生型藻種CC-125 的全細胞蛋白質(zhì)提取物進行免疫印跡分析。 如圖7 所示，純化后的IFT20 抗體可以特異性識別萊茵衣藻內(nèi)源性IFT20 蛋白。

2.5 討論

研究萊茵衣藻IFT20 在鞭毛組裝中的功能需要一支高特異性識別內(nèi)源IFT20 蛋白的抗體。 在大腸桿菌中表達了N 端6×His 標簽標記的萊茵衣藻IFT20 融合蛋白6×His：：IFT20， 經(jīng)鎳柱純化后獲得純度約85%的6×His：：IFT20 融合蛋白，以該融合蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔獲得IFT20 抗血清。 然而，用Protein A 富集的IFT20 IgG 對萊茵衣藻野生型藻種CC-125 全細胞蛋白質(zhì)提取物中的IFT20 內(nèi)源蛋白識別特異性較差，究其原因可能是該抗體的非特異性交叉識別比較嚴重，反映在免疫印跡上就是非特異性蛋白質(zhì)雜帶過多。這可能是純化后的6×His：：IFT20 融合蛋白抗原中依然存有非融合蛋白質(zhì)組分，影響了動物免疫效果，但也可能是兔源抗體的特點，其抗血清本身特異性較差。 為了進一步提高IFT20 抗體的特異性，對Protein A 富集的IgG進行了抗原抗體親和純化，免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)二次純化的IFT20 抗體能特異性識別萊茵衣藻內(nèi)源性IFT20 蛋白。因此，二次純化策略將采用一種標準程序用來開發(fā)后續(xù)萊茵衣藻兔源多克隆抗體。 在后續(xù)抗體測試中，我們將用該IFT20 抗體對萊茵衣藻細胞進行免疫熒光染色及免疫共沉淀分析，探索其在這2 種類型的實驗中應(yīng)用的可能性。

3 結(jié) 語

鞭毛是一種特異化細胞“天線”，在細胞分裂、發(fā)育以及分化中均起著重要作用[21]。 鞭毛組裝依賴IFT 這一雙向運輸機制來完成。 在這一過程中，IFT-A 蛋白復合物單一組分蛋白質(zhì)缺失將破壞IFT-A 穩(wěn)定性，進而影響IFT 反向運輸，從而形成膨大的缺陷鞭毛[22]。 大部分IFT-B 蛋白復合物單一組 分 如IFT38[23]、IFT46[24]和IFT54[7]等 缺 失 則 只 影 響IFT 正向運輸，最終導致鞭毛組裝缺陷。 少數(shù)IFT-B蛋白復合物單一組分如IFT22[20]、IFT25[25]和IFT27[26]的缺失并不影響IFT 正向運輸，因此不會影響鞭毛組裝。目前已知IFT54 缺失破壞了IFT20 的穩(wěn)定性[27]，而IFT20 缺失則可導致鞭毛組裝受阻[28]。 這說明IFT20 與其他大部分IFT-B 單一組分蛋白質(zhì)一樣，在鞭毛組裝中起著重要作用。到目前為止，IFT20 調(diào)控鞭毛組裝的分子機制仍不清晰， 其功能有待進一步研究。