發酵蔬菜源食品用益生乳酸菌的篩選及降膽固醇能力評價

杜 秋， 周 曉， 覃業優， 胡嘉亮， 劉 洋， 蔣立文*

（1.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 瀏陽 410300）

聯 合 國 糧 農 組 織 （FAO）、 世 界 衛 生 組 織（WHO）、國際益生菌和益生元科學協會（ISAPP）以及國際乳業聯盟（IDF）對益生菌給出了定義：益生菌是活的微生物，當攝入足夠數量時，對宿主的健康產生益處[1]。 因此，益生菌應具備足夠數量、活菌狀態和有益健康功能這三大特征[2]。 2003 年，FAO/WHO 提出了一套評價食品用益生菌的系統方法指南《食品中益生菌評價指南》，制定了益生菌的基本標準[3]；2022 年中國食品科學技術學會（CIFST）發布的《食品用益生菌通則》（以下簡稱通則），明確規定食品用益生菌活菌數應大于（或等于）1×108CFU/mL或1×108CFU/g，并定義了食品用益生菌為可用于食品中的一種或多種益生菌，經發酵、富集、干燥或不干燥、混合或不混合、包裝等工序制成的食品原料[4]。 通則對食品用益生菌的評價要求進行了系統的闡述，要求應在菌株水平進行鑒定、安全評價和健康作用評價[5]。

乳酸菌（lactic acid bacterium，簡稱LAB）來源廣泛，隨著對大健康的重視，植物源乳酸菌已引起業內的關注[6]。 傳統發酵蔬菜是以蔬菜為原料，利用微生物自然發酵的冷加工食品[7]。 在我國不同地區有著豐富的傳統發酵蔬菜制品[8]。 已有研究發現，不同地區的發酵蔬菜的微生物組成群落存在顯著差異，但其優勢細菌菌群主要為乳酸菌[9]。 因此，傳統發酵蔬菜為植物源益生乳酸菌篩選提供了強大的資源庫[10]。 由于植物源乳酸菌分離難度低、容易獲得[11]，且植物源乳酸菌與動物源乳酸菌對胃腸液具有類似的抗性[12]，所以對發酵蔬菜源益生乳酸菌的研究已成為該產業的一個熱點。 目前，國外對發酵蔬菜中益生菌研究較多的是韓國泡菜[13-14]，而我國研究較多的是四川泡菜、東北酸菜[15]，而其他地區的報道相對較少。 作者從不同地區自制的傳統發酵蔬菜中分離乳酸菌，對傳統發酵蔬菜源乳酸菌進行了系統益生性評價及鑒定，并分析了益生特性降膽固醇能力，旨在開發符合食品用益生菌要求的發酵蔬菜源益生乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品湖南剁辣椒、湖南芥菜、云南剁辣椒、廣西發酵酸筍等共計17 個樣品。

1.1.2 對照菌株 （RW）融合魏斯氏菌（Weissella confusa） CWY578262：革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，顯微鏡下呈短桿狀或球狀，具有益生菌的基本特性，還具有富產胞外多糖的特性[16]。

1.1.3 CaCO3-MRS 瓊脂培養基MRS 瓊脂培養基1 L、CaCO3（質量濃度25 g/L）、pH 6.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.4 MRS-CHOL 肉湯培養基蔗糖酯0.1 g，膽固醇0.1 g，牛膽鹽0.2 g，吐溫80 1 mL，加冰乙酸5 mL，攪拌均勻，超聲溶解趁熱過0.45 μm 濾膜到1 L MRS 肉湯培養基中，pH 6.0～7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.5 氨基酸脫羧酶培養基MRS 瓊脂培養基1 L，組氨酸、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸等1 g/L，溴甲酚紫0.06 g/L，pH 5.5～6.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min[17]。

1.1.6 試劑膽固醇、蔗糖酯、抗生素：源葉生物科技有限公司；鄰苯二甲醛、組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸：國藥集團化學試劑有限公司；MRS肉湯培養基、MRS 瓊脂培養基、PCA 瓊脂培養基：廣東環凱微生物科技有限公司； 胃蛋白酶（酶活250 U/mg）、胰酶（酶活250 U/mg）：南京都萊生物技術有限公司；牛膽鹽：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP120 恒溫培養箱： 上海實驗儀器廠有限公司；HY45 恒溫搖床： 深圳匯成科技有限公司；LDZX-50KBS 立式高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械有限公司；CX23 光學顯微鏡： 日本Olympus 公司；ReadMax 1900 光吸收型全波長酶標儀：上海閃譜生物科技有限公司；TG16-WS 臺式高速離心機： 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 乳酸菌的分離鑒定

1.3.1 乳酸菌的分離及形態學鑒定取10 g 樣品加入90 mL 無菌生理鹽水中，搖勻后取適宜梯度稀釋液100 μL 均勻涂布于CaCO3-MRS 瓊脂培養基上，37 ℃倒置培養3 d。選取不同菌落形態且溶鈣圈較大的單菌落劃線至MRS 固體培養基上， 反復劃線純化，通過革蘭氏染色篩選出符合乳酸菌條件的菌株。 初篩得到的乳酸菌保存于含體積分數40%甘油的MRS 肉湯培養基中，于-20 ℃冷凍保存。

1.3.2 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力參考劉璐等的方法加以修改[18]，將傳代3 代的實驗菌株以體積分數3%分別接種于pH 值為2.0、質量濃度為3 g/L 牛膽鹽的MRS 肉湯培養基中，立即取樣測600 nm 處的吸光度， 剩余混合液于37 ℃、120 r/min 振蕩培養，12 h 時取樣，測定600 nm 處的吸光度A1，存活率按式（1）計算。

式中：R1為菌株耐酸/耐膽鹽存活率，%；A1為12 h樣品的吸光度；A0為0 h 樣品的吸光度。

1.4 乳酸菌的生物特性評價

1.4.1 對條件致病菌的拮抗活性用瓊脂孔擴散法測定待測菌株的抗菌活性， 以大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）為指示菌。指示菌（107CFU/mL）與無菌PCA 瓊脂培養基以1∶10 充分混勻后倒入放有多個無菌牛津杯的平板中，待加有病原菌的PCA 瓊脂培養基冷卻凝固后，用無菌鑷子取出牛津杯，即形成若干瓊脂孔。 分別向瓊脂孔里加入100 μL 待檢菌（107CFU/mL）的離心上清液于9 000 r/min 離心5 min，37 ℃培養12 h，游標卡尺測量抑菌圈直徑[19]。

1.4.2 乳酸菌對胃/腸模擬液耐受性實驗參考費永濤等的方法制備人工胃/腸液[20]。 將活化至3 代的菌液，用無菌PBS（pH 7.0）清洗3 次（8 000 r/min 離心10 min），用PBS（pH 7.0）反復吹打菌泥，混勻，制成供試菌懸液（1×108CFU/mL）。 移取1 mL 菌懸液接種于9 mL 人工胃液中，混勻，立即取樣通過平板計數法測定其活菌數N0， 剩余混合液置于37 ℃恒溫培養箱中培養，3 h 時取樣測定其活菌數N1。將在模擬胃液中孵育3 h 后的菌液， 取1 mL 接種于9 mL 人工腸液中，混勻，立即取樣平板計數測定其活菌數N0， 剩余混合液于37 ℃培養3 h 后取樣測定其活菌數N1，存活率按式（2）計算。

式中：R2為人工胃/腸液存活率，%；N1為人工胃液/腸液處理3 h 后LAB 的活菌數，CFU/mL；N0為人工胃液/腸液處理0 h 后LAB 的活菌數，CFU/mL。

1.5 乳酸菌的安全性評價

1.5.1 抗生素耐藥性安全性評價將純化培養后的乳酸菌菌液濃度調整為1×108CFU/mL，取100 μL菌液涂布于MRS 固體培養基， 待菌液吸收后放置藥敏紙片，37 ℃培養24 h。每組重復3 次，記錄抑菌圈直徑，根據表1 進行藥物敏感性判定。

表1 微生物藥物敏感實驗執行標準Table 1 Criteria for microbial drug susceptibility test

耐存率按式（3）計算：

式中：R3為乳酸菌耐藥率，%；N1為耐藥和中介菌株總數，CFU；N0為實驗菌株總數，CFU。

1.5.2 乳酸菌γ-溶血實驗將供試菌株點接于脫纖維綿羊血瓊脂平板上， 以金黃色葡萄球菌為對照，37 ℃培養24 h 后觀察菌落是否具有溶血現象。

1.5.3 乳酸菌氨基酸脫羧酶活性實驗將乳酸菌點接在氨基酸脫羧酶培養基上，37 ℃培養24 h 后觀察菌落周圍顏色變化，若培養基變成紫色，即氨基酸脫羧酶活性陽性，則具有潛在產胺威脅；若為黃色，即氨基酸脫羧酶活性陰性，該乳酸菌無潛在產胺威脅。

1.6 乳酸菌的降膽固醇能力評價

參考余萍等[21]的方法稍做修改，將活化3 代后的乳酸菌調節菌濃度為1×108CFU/mL，按體積分數3%接種至MRS-CHOL 培養基中，37 ℃培養48 h后，9 000 r/min 離心5 min，取上清液，采用鄰苯二甲醛比色法測定550 nm 處的吸光度， 膽固醇去除率見式（4）。

式中：R4為膽固醇去除率，%；A0為未接種菌株培養48 h 后離心上清液的吸光度；A1為接種培養48 h后離心上清液的吸光度。

1.7 乳酸菌對Caco-2 細胞黏附能力評價

參考郭志華等的方法， 將Caco-2 細胞密度調整為1×105CFU/mL， 并分裝于24 孔培養板中培養至單層細胞待用[22]。取2 mL 待測菌液（108CFU/mL）于9 000 r/min 離心5 min，用2 mL DMEM 培養基將菌體重懸并進行菌落計數（M0），剩余混合液取200 μL加入24 孔板中，于37 ℃、體積分數5% CO2孵育1 h 后用PBS（pH 7.0）清洗細胞表面未黏附的乳酸菌，加入2 mL 胰酶消化5 min 后用2 mL DMEM 培養基重懸并進行活菌計數（M1）。 黏附率按照式（5）計算。 乳酸菌活菌計數參照申文熹等的方法進行菌落計數[23]。

式中：R5為乳酸菌黏附率，%；M1為黏附的乳酸菌的菌落總數，CFU/mL；M0為待測重懸液菌落總數，CFU/mL。

1.8 乳酸菌的分子生物學鑒定

1.8.1 菌株鑒定將乳酸菌純化3 代后委托杭州聯川生物有限公司進行16S rDNA 測序鑒定。

1.8.2 同源性分析利用BlAST 網站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）找到與鑒定菌株同源性最高的菌株并下載序列， 使用MEGA7 軟件構建系統發育樹。

1.9 數據分析

分析、計算、圖表繪制分別采用DPS 數據處理軟件和OriginPro 2021（64-bit）軟件。 各實驗組重復3 次，以平均值±標準差（±s）表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的初步篩選結果

傳統發酵蔬菜樣品經過菌種分離純化，篩選出革蘭氏陽性的96 株溶鈣菌株，初篩判斷為乳酸菌。部分菌落形態與鏡檢結果見圖1。

圖1 乳酸菌菌落形態及革蘭氏染色結果Fig.1 Colonial morphology and gram staining results of LAB

2.2 乳酸菌對酸和膽鹽耐受特性

益生菌需要到達腸道才能發揮其益生功能。 益生菌從口腔到人體腸道的過程中需要耐受胃中的低pH 環境[23]，以適應小腸中膽鹽脅迫[24]等不良環境[25]。因此，具有耐受人體胃腸道環境的抗逆能力已經成為評價益生菌的一項重要指標[26]。 作者將初篩獲得的菌株依次在pH 2.0 和質量濃度3 g/L 牛膽鹽的MRS 液體培養基中處理12 h 進行篩選。 如圖2（a） 所示，96 株乳酸菌經pH 2.0 培養12 h 后得到25株乳酸菌且存活率在65%以上， 其中有10 株菌活菌數較之前有所增加，表明耐酸能力強。 25 株耐酸乳酸菌經質量濃度3 g/L 牛膽鹽處理12 h 后，有24株乳酸菌能存活，存活率在35%以上，見圖2（b）。 表明這24 株菌對酸和膽鹽具有良好的耐受性。

圖2 乳酸菌的耐酸性及膽鹽耐受性實驗結果Fig.2 Acid tolerance and bile salt tolerance tests results of LAB

2.3 生物特性評價

2.3.1 抑菌實驗乳酸菌可以抑制病原菌的生長繁殖，有助于胃腸道環境健康[27]。 24 株乳酸菌對病原菌抑菌能力的檢測結果見表2。 37 ℃培養12 h后， 有22 株菌株對金黃色葡萄球菌有顯著抑菌效果，平均抑菌直徑為（30.60±0.46） mm；所有菌株對枯草芽孢桿菌都有抑菌效果， 平均抑菌直徑為（19.87±0.30） mm。表明大多數乳酸菌對所選擇的革蘭氏陽性病原菌具有顯著抑菌效果。 多數菌株對大腸桿菌也具有抑菌效果， 平均抑菌直徑為（12.20±0.35） mm， 表明實驗菌株對大腸桿菌抑菌能力一般。 值得注意的是，菌株SY4、SY32、JC3-1、JCMC、JC4-1 對大腸桿菌沒有抑菌效果， 菌株JCSMC-3、JCSMC16 對金黃色葡萄球菌沒有抑菌效果；而其余17 株菌株對3 株病原菌均有抑菌效果，表明其抑菌譜較廣且抑菌能力更強。

表2 乳酸菌對病原菌的抑菌直徑Table 2 Inhibition zone diameter of LAB against pathogenic bacteria 單位：mm

2.3.2 模擬胃腸液耐受特性評價乳酸菌在胃腸消化過程中，除了受低酸和膽鹽的影響，各種消化酶也會影響乳酸菌最終到達腸道的活菌數[28-29]。 作者以RW 為參考， 測定24 株乳酸菌在模擬胃/腸液中的存活情況。 由表3 可知，24 株菌株在模擬胃液中處理3 h 均能存活，但其存活能力存在差異。菌株SY4、JC33-1、XSMC1、JC-1 在模擬胃液中存活率較高，均大于100%。 菌株SY32、JC4-1、SY31、JCMC、SYA、JCSMC-2、XSMC2-2、SYD、JCSMC16 在模擬胃液中的存活率（55.83%～87.64%）高于RW 的存活率（48.80%）。 其余11 株的存活率低于融合魏斯菌，其中XSMC2-3 的存活率最低（3.08%），但活菌數仍高于106CFU/mL。

表3 乳酸菌在人工胃腸液中的活菌數及存活率Table 3 Viable count and survival rates of LAB in artificial gastrointestinal fluids

24 株實驗菌株經模擬腸液處理3 h 后，除菌株SY31 和JCSMC-2 對模擬腸液無耐受能力， 其余菌株對模擬腸液均表現出不同程度的耐受能力，見表3。 其中菌株XSMC2-3 耐受能力較弱，活菌數僅有7.55×105CFU/mL， 表明菌株XSMC2-3 受到模擬腸液的影響較大。

2.4 安全性評價

通過對實驗菌株的生物特性評價，選擇抑菌譜較廣、抑菌能力較強且對胃腸道環境耐受能力強的18 株乳酸菌進行安全性評價。 18 株菌株對9 種抗生素的耐藥性檢測結果見表4。 18 株乳酸菌對四環素、氯霉素、氨芐西林、紅霉素具有敏感性；對萬古霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素具有耐藥性。 據報道，多數乳酸菌對糖肽類（萬古霉素）和氨基糖苷類（慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素）的抗生素具有天然耐受能力[30-31]。 克林霉素主要是通過抑制細菌蛋白質合成從而達到抑菌效果[32]，因此35%的供試菌株的蛋白質合成不受克林霉素抑制， 表現出耐藥性。18 株供試菌株均無溶血現象且在氨基酸脫羧酶培養基上呈陰性，表明這18 株試驗菌株均為安全菌株。

表4 乳酸菌對不同抗生素的耐藥性Table 4 Resistance of LAB to different antibiotics

2.5 益生乳酸菌降解膽固醇能力評價

由圖3 可知，18 株乳酸菌培養48 h 后膽固醇的去除率均大于40%。 對照菌株RW 培養48 h 后膽固醇去除率達到54.56%。 除JC4-1、JCSMC16、JC33-1、JCSMC-3、XSMC2-2 外其余13 株菌株的膽固醇去除率則高于RW 的膽固醇去除率，其中菌株SYD 的膽固醇去除率高達62.54%。

圖3 乳酸菌的膽固醇降解率Fig.3 Rate of cholesterol removal by LAB

2.6 益生乳酸菌對Caco-2 黏附能力的評價

13 株降膽固醇益生乳酸菌對Caco-2 細胞的黏附率見圖4。有9 株乳酸菌對Caco-2 細胞的黏附率高于對照菌株RW 的黏附率 （62.10%）， 其中菌株SYB 的黏附率高達81.74%；余下菌株的黏附率均低于RW 的黏附率（62.10%），但均在45%以上。 黏附性強的乳酸菌更容易在腸道中定植[33-35]，從而發揮益生作用。 故選擇黏附率前5 名的菌株進行鑒定。

圖4 乳酸菌對Caco-2 細胞的黏附作用Fig.4 Adhesion of LAB to Caco-2 cells

2.7 乳酸菌16SrDNA 分子鑒定結果

通過構建的系統發育樹獲得同源菌株信息見表5。 可知菌株JCSMC-1 與植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum），菌株SYB、JCSMC6-2 與植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum）， 菌株SYD、XSMC-1 與 副 干 酪 乳 酸 菌（Lacticaseibacillus paracasei）的親緣關系分別最近，且序列相似性均高達100%。

表5 乳酸菌鑒定結果Table 5 Identification of LAB

3 結 語

本研究篩選得到的5 株發酵蔬菜源益生乳酸菌JCSMC-1、SYB、JCSMC6-2、SYD、XSMC-1 具 有較好的膽固醇去除能力（45.55%～62.54%）。同時，對酸、膽鹽和模擬胃/腸液耐受性強，對Caco-2 細胞黏附性也強；另外，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌具有一定的抑菌效果，且在綿羊血培養基均沒有溶血現象，經氨基酸脫羧酶培養基檢測表明沒有產生物胺的潛在威脅；5 株菌株對所選用的6 種抗生素表現出敏感性，3 種（1 種糖肽類、2 種氨基糖苷類）抗生素表現出耐藥性，這可能是乳酸菌對糖肽類和氨基糖苷類抗生素具有天然耐受能力；經16S rDNA 鑒定， 菌株JCSMC-1 為植物乳植桿菌，SYB、JCSMC6-2 為植物乳桿菌，SYD、XSMC-1為副干酪乳酸菌。綜上所述，5 株菌株可作為潛在的食品用益生菌，進一步用于功能性乳制品的開發。