Ag-HA/TiO2抗菌劑的制備及在大黃魚中的應用

李超群， 石 娟， 周麗萍， 王 晴， 婁永江

（寧波大學 食品與藥學學院，浙江 寧波 315832）

大黃魚肉嫩味鮮，富含蛋白質、維生素及微量元素等，是我國六大優勢養殖水產品和主要海產經濟魚類之一[1-3]。 海水魚在內源性酶降解、脂肪氧化和微生物作用下，極易腐敗變質，其中微生物生長及代謝起決定性作用[4]。 隨著人們生活水平的提高，食品安全性已成為各國普遍關注的重大問題，為了避免食物致病菌威脅人體健康，研發綠色、高效、環保的抗菌劑對海產品的鮮度保持、儲存和銷售有著十分重要的意義[1，5]。 生物抗菌劑的有效成分含量低、天然成分提取難度大、成本高[6]，因此探索安全有效的新型復合無機抗菌劑正成為研究熱點，但目前相關報道還較少。

在自然界中很多金屬離子具有抑制和殺滅微生物的作用，其中銀離子在所有金屬離子中抗菌能力最強，濃度低、效果好、安全無毒[7]。 載銀羥基磷灰石（AgHAp）在醫學和陶瓷等抗菌處理中廣泛應用，且有研究證明載銀羥基磷灰石（AgHAp）具有緩釋性、抗菌持久性和生物安全性等特點[8-10]，但目前還需進一步探索銀納米材料新的應用領域。

由于銀價格昂貴，在光照和紫外線條件下其抗菌效果會降低，導致載銀羥基磷灰石的應用受到很大限制[5]。 二氧化鈦（TiO2）作為食品添加劑和抗菌劑[11-13]，具有光催化能力，成本低，不但可以殺死絕大多數的微生物，還能降低有機污染，在殺菌的過程中不消耗自身體積，具有持久的抗菌性能[14]。綜合AgHAp 和TiO2兩者的優點， 將銀離子與二氧化鈦結合在一起，當沒有光或紫外線時，銀離子單獨發揮抗菌作用；當有光或紫外線時，不僅二氧化鈦能發揮光催化作用殺死細菌， 而且銀離子也能抗菌，因此可制備一種兼具光催化抗菌和金屬抗菌功能的新型抗菌劑，既可以降低銀含量，同時又能獲得更加高效持久的抗菌效果[5，15]。

作者采用貽貝殼制備的AgHAp 和Ag-HA/TiO2抗菌劑，首先通過X 射線衍射（XRD）、傅里葉紅外光譜（FTIR）和電感耦合等離子體發射光譜（ICPOES）觀察載銀羥基磷灰石/二氧化鈦（Ag-HA/TiO2）的結構表征， 并探討了貽貝殼AgHAp 和Ag-HA/TiO2的抗菌性能，以期研究載銀羥基磷灰石加入二氧化鈦后對其結構和抗菌效果的影響。 選用2 種常見的水產品特定腐敗菌 （SSOs）——熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌，研究載銀羥基磷灰石/二氧化鈦是否對SSOs 菌群有抗菌效果， 以及載銀羥基磷灰石/二氧化鈦抗菌材料對大黃魚中微生物變化的影響，旨在提高貝殼的資源利用率和產品附加值， 為Ag-HA/TiO2抗菌劑在水產品保鮮領域上的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料以貝殼為原料自制的球形羥基磷灰石，送中國科學院寧波材料技術與工程研究所檢測為純羥基磷灰石。

1.1.2 實驗菌種大腸桿菌 （Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella baltica）、 熒 光 假 單 胞 菌（P.fluorescens）：均購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 實驗試劑LB 液體培養基、LB 固體培養基、NA 培養基、PCA 培養基： 杭州微生物試劑有限公司；硝酸銀（AgNO3）、二氧化鈦（TiO2）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

渦旋儀MX-S：美國Scilogex 公司；X 射線粉末衍射儀（XRD）：D8 Advance，Bruker 公司；智能型傅里葉紅外光譜儀（FTIR）：Nicolet 6700，美國Thermo Fisher 公司； 電感耦合等離子體發射光譜儀（ICPOES）：SPECTRO ARCOS 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 AgHAp 和Ag-HA/TiO2 的 制 備4 g HA 加入100 mL 水，超聲波分散，加入100 mL 質量濃度為2 g/L 的硝酸銀，常溫反應7 h，過濾，去離子水洗滌，60 ℃烘干，研磨過300 目篩得載銀羥基磷灰石。有光條件下制得灰黑色AgHAp 粉末樣品， 避光條件下制得棕黃色AgHAp 粉末樣品。

將5.3 g 的TiO2加入4 g HA，靜置24 h，去離子水清洗，避光環境下加入50 mL 質量濃度為2 g/L的硝酸銀反應7 h，洗滌烘干，研磨過300 目篩制得Ag-HA/TiO2復合材料樣品。

1.3.2 表征方法

1）XRD 標 識X 射 線、Cu-Kα 輻 射， 波 長0.154 06 nm，電壓40 kV，電流40 mA，掃描范圍5°～90°，每步掃描時間為0.2 s，溫度20 ℃，相對濕度50%。 使用高分子樣品架將樣品用平板玻璃壓平，X 射線衍射儀測量。

2）FTIR 溴化鉀（KBr）壓片，掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描次數為32 次/min。

3）ICP-OES 將制得的樣品各取0.5 g，根據國標法溶解于100 mL 稀硝酸（V硝酸∶V水=5∶95）中，溶解后取1 mL 定容到250 mL，之后用ICP-OES 測試溶液中元素的濃度[16]。

1.3.3 Ag-HA/TiO2 的抗菌性測定

1）AgHAp 和Ag-HA/TiO2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能 分別取10 mg 的灰黑色和棕黃色AgHAp、Ag-HA/TiO2、 山梨酸鉀放入10 mL試管中備用，另準備空白試管做對照[17]。 用0.9 g/dL的生理鹽水制備菌懸液，進行10 倍稀釋法，選擇2～3 個適宜稀釋度， 取1 mL 菌懸液加入上述試管中。將上述試管在200 r/min、37 ℃的搖床中搖動2 h，取0.1 mL 涂布平板，放入37 ℃恒溫箱中培養24 h，計菌落總數。

式中：I 為抑菌率，%；C0為空白組實驗中的細菌數量，CFU/mL；C 為樣品組實驗中的細菌數量，CFU/mL。

2）Ag-HA/TiO2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC） 用0.9 g/dL 的生理鹽水制備105CFU/mL 的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液，放入4 ℃冰箱中備用[9]。取0.04 g 的Ag-HA/TiO2抗菌材料放入試管中，然后加入2 mL 營養培養液，超聲處理使其充分混合，將懸濁液進行連續6 次兩倍稀釋， 另準備空白試管， 只加入1 mL 營養培養液，然后在每支試管中加入0.05 mL 的菌懸液。將上述試管置于37 ℃、200 r/min 的搖床中培養18～24 h。在培養結束前1 h 停止搖晃，使懸濁液沉淀，將加抗菌粉體的試管與沒有加抗菌粉體的試管做對照，處理液濁度和對比液濁度相等的體系中抗菌劑的質量濃度即為MIC。

1.3.4 Ag-HA/TiO2 對SSOs 菌種的抗菌性能測定選用2 種在水產品中常見的優勢細菌——熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌， 分別取10 mg Ag-HA/TiO2、山梨酸鉀放入10 mL 試管中備用，另準備空白試管做對照。用0.9 g/dL 的生理鹽水制備菌懸液，采用10 倍稀釋法， 選擇2～3 個適宜稀釋度， 取1 mL菌懸液加入上述試管中。 將上述試管于200 r/min、30 ℃的搖床中搖動0.5、1.0、1.5 h。 從上述試管中取0.1 mL 涂布平板，放入30 ℃恒溫箱中，培養24 h，計菌落總數，抑菌率計算同上。

1.3.5 Ag-HA/TiO2 對大黃魚抑菌性能測定將若干相同質量的大黃魚肉塊置于0、0.125、0.25 g/dL的Ag-HA/TiO2懸濁液中浸泡5 min， 以及在0.125 g/dL 的Ag-HA/TiO2懸濁液中浸泡0、5、15、25 min，取出瀝凈水分，按不同的浸泡方法分別裝入多個無菌封口袋中，并置于4 ℃條件下。 根據GB 4789.2—2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》分別測試1、3、5、7 d 下的菌落總數。

1.4 數據處理

XRD、FTIR、ICP-OES 的數據為中國科學院寧波材料技術與工程研究所測試中心獲取。 使用Origin 9.0 及SPSS 進行作圖和數據分析處理， 每組實驗重復3 次，圖中不同字母代表樣品存在顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與討論

2.1 XRD 表征分析產物結構

如圖1 所示，AgHAp（樣品a、樣品b）的XRD圖譜與HA 圖譜很相似，在2θ 為26°、32°、34°、40°、47°和50°附近都有其特征峰，2 個圖譜比較相近，說明載銀后羥基磷灰石仍然保持原有的晶形結構[18]。Ag-HA/TiO2（樣品d）也都有羥基磷灰石的特征峰，說明也保持了原有的晶形結構， 但TiO2特征峰2θ為32°，與HA 的特征峰重疊了，說明鈣離子部分被銀離子取代，導致晶格常數增大[9]。

圖1 樣品a、b、d 的XRD 圖譜Fig.1 XRD patterns of samples a, b and d

2.2 FTIR 表征定性分析

圖2 為AgHAp （樣品a、 樣品b）、Ag-HA/TiO2（樣品d）的紅外圖譜。 在AgHAp 光譜圖中，在3 440、1 636、1 443、1 037、862、604、566 cm-1處存在明顯吸收峰， 其中566、604、862、1 037 cm-1處的吸收峰為PO43-振動引起；在1 443 cm-1產生的分裂峰可能由于碳酸進入羥基磷灰石內部造成，是由于空氣中的二氧化碳進入反應體系中，替代羥基磷灰石中的羥基產生[19]；在1 636、3 440 cm-1處的吸收峰為羥基—OH 吸收峰。 這些都說明AgHAp 基本結構是由羥基磷灰石架構組成。

a：灰黑色AgHAp；b：棕黃色AgHAp；d：Ag-HA/TiO2。

在HA 同時載銀和TiO2后，其吸收峰光譜吸收峰位置并沒有發生明顯改變，但在862 cm-1處的吸收峰消失，604 cm-1和566 cm-1處的吸收峰強度明顯減弱并且呈寬化的趨勢，主要是由于PO43-振動峰與TiO2（600～400 cm-1） 的耦合振動產生， 說明AgHAp 和TiO2復合效果較好[5]。

2.3 ICP-OES 表征測定元素質量分數

根據呂國玉[5]和馮晉陽[20]等的研究，不管在光照還是無光的情況下，AgHAp 中銀離子的質量分數一般在3.00%左右。Ag-HA/TiO2中銀離子的質量分數為1.76%，鈦離子的質量分數為31.5%，銀離子質量分數明顯降低。

2.4 Ag-HA/TiO2 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能

2.4.1 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖3 為不同實驗材料作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌結果。 AgHAp（樣品a、樣品b）和Ag-HA/TiO2（樣品d）的抗菌效果與山梨酸鉀有顯著性差異，AgHAp 和Ag-HA/TiO2之間沒有顯著性差異，但是灰黑色的AgHAp（樣品a）抗菌效果略弱于棕黃色的AgHAp（樣品b）和Ag-HA/TiO2，說明銀離子在光照條件下變色導致抗菌效果減弱。 樣品a 對大腸桿菌的抑菌率為（98.04±0.78）%，對金黃色葡萄球菌的抑菌率為（99.58±0.32）%；樣品b 對大腸桿菌的抑菌率為100%， 對金黃色葡萄球菌的抑菌率為（99.67±0.47）%，與其他研究中鈣磷鹽和銀離子制備的AgHAp 抗菌效果接近[21-22]，說明貝殼粉AgHAp可以代替鈣磷鹽AgHAp，達到提高貝殼資源利用率和節約成本的作用。 可以看出，Ag-HA/TiO2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均為100%， 說明其抗菌效果沒有因為銀離子質量分數的降低而減弱， 且TiO2的加入使銀離子和TiO2發揮協同作用獲得了更好的抗菌效果，不僅增強抗菌性，還可能由于TiO2對光的吸收作用抑制銀離子的變色，進一步延長Ag-HA/TiO2的抗菌持久性。

圖3 不同抗菌粉體對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果Fig.3 Antibacterial effects of different antibacterial powders on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.4.2 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌質量濃度 （MIC）Ag-HA/TiO2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 值均為312.5 μg/mL， 測試數據符合日本抗菌協會制定的《銀等無機抗菌劑的自主規格及其抗菌試驗法》中規定的無機抗菌劑抗菌性能要求，MIC 值小于800 μg/mL[5，23]。 在實際應用中，高載銀量一方面會提高生產成本，不利于工業化生產。 另一方面可能會造成銀離子超標，引起重金屬污染[23]，因此盡量降低載銀量。

2.5 Ag-HA/TiO2 對熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌的抑菌效果

圖4～5 為Ag-HA/TiO2和山梨酸鉀對熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌抑菌率的柱狀圖。 可以看出，樣品對菌種的抗菌效果隨著作用時間的增長沒有顯著性差異， 但Ag-HA/TiO2的抗菌效果明顯比山梨酸鉀的抗菌效果要好。而Ag-HA/TiO2與熒光假單胞菌的作用時間為0.5 h 時抑菌率為（97.58±3.43）%，1.0 h 和1.5 h 時抑菌率為100%； 與腐敗希瓦氏菌在3 個不同作用時間的抑菌率均為100%。 實驗樣品的菌落總數顯著低于對照樣品，表明Ag-HA/TiO2抗菌劑對這2 種水產品特定腐敗菌有很強的抑菌作用，有望成為一種較理想的水產保鮮材料。

圖4 不同作用時間下樣品對熒光假單胞菌的抑菌率Fig.4 Inhibition rate of samples against Pseudomonas fluorescens under different treated time

圖5 不同作用時間下樣品對腐敗希瓦氏菌的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of samples against Shewanella putrefaction under different treated time

2.6 Ag-HA/TiO2 處理對大黃魚中微生物的影響

魚死后，隨著冰藏時間的延長，其體內微生物的增長和繁殖是導致魚肉腐敗變質的主要原因，因此，在貯藏過程中檢測魚肉中微生物動態變化能夠反映魚體新鮮程度[24]。 如圖6 所示，在貯藏初期，3組的菌落總數相差不大， 隨著貯藏時間的加長，0 g Ag-HA/TiO2處理后菌落總數在第7 天為（5.34±0.1）lg （CFU/g），增長最快；0.125 g Ag-HA/TiO2處理后的菌落總數在第7 天為 （5.06±0.05） lg （CFU/g）；0.250 g Ag-HA/TiO2處理后的菌落總數在第7 天為（4.8±0.04） lg （CFU/g），增長最慢，菌落總數也明顯低于其他2 組， 說明在浸泡作用時間同為5 min 的情況下，隨著Ag-HA/TiO2質量的增加，抑菌效果變好。0 g 與0.125、0.250 g Ag-HA/TiO2處理后的大黃魚具有顯著性差異，Ag-HA/TiO2處理后大黃魚抑制細菌生長效果明顯。 參考標準規定一級鮮肉菌落總數小于4 lg （CFU/g），0 g Ag-HA/TiO2浸泡的大黃魚在第1 天菌落總數為（4.23±0.04） lg （CFU/g）的情況下，0.25 g Ag-HA/TiO2浸泡的大黃魚第5 天菌落總數為（3.87±0.15） lg （CFU/g），未超過4 lg （CFU/g），延長了一級鮮肉貨架期[25-27]。

圖6 不同質量Ag-HA/TiO2 處理后大黃魚貯藏期間菌落總數的變化Fig.6 Changes of the total number of colonies of large yellow croaker treated with different content of Ag-HA/TiO2 during storage

由圖7 可以看出， 隨著冰藏時間的延長，Ag-HA/TiO2浸泡時間越長抑菌效果越好。 浸泡時間為0 min 時，在大黃魚菌落總數為（4.16±0.06）lg （CFU/g）的情況下，浸泡15 min 時第1 天菌落總數為（3.84±0.04） lg （CFU/g），符合一級鮮肉標準；浸泡25 min時第5 天菌落總數為（3.70±0.09） lg （CFU/g），仍未超過一級鮮肉標準， 與在0.250 g 的Ag-HA/TiO2中浸泡5 min 時延長貨架期的效果相同。

圖7 Ag-HA/TiO2 處理不同時間大黃魚后貯藏期間菌落總數的變化Fig.7 Changes in the total number of colonies of large yellow croaker treated with Ag-HA/TiO2 for different time during storage

由圖6～7 可以看出， 經過Ag-HA/TiO2浸泡液處理過的大黃魚與未經過處理的大黃魚菌落總數有明顯差異，菌落總數在1～5 d 抑菌效果明顯，且隨著質量和時間的增加， 在3～5 d 菌落總數甚至開始出現下降的情況， 證明在這段時間內Ag-HA/TiO2抑制和殺滅細菌的效果最好。

3 結 語

為了降低AgHAp 的銀離子質量， 同時又能獲得高效的抗菌性，將AgHAp 和TiO2結合起來，制備的Ag-HA/TiO2的銀離子的質量分數降低為1.76%，負載銀和TiO2后HA 晶體結構沒有發生明顯變化；貝殼AgHAp 的抗菌效果與鈣磷鹽AgHAp 抗菌效果接近，解決傳統上鈣磷鹽成本大和廢棄貝殼污染環境的問題；Ag-HA/TiO2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均為100%， 最小抑菌質量濃度均為312.5 μg/mL， 效果優于AgHAp；10 mg/mL Ag-HA/TiO2作用0.5 h 時對假單胞菌和希瓦氏菌的抑菌率分別為（97.58±3.43）%和100%，作用時間1.0、1.5 h時抑菌率均為100%，抑菌效果強；Ag-HA/TiO2能抑制大黃魚中細菌的生長， 延長一級鮮肉的貨架期，為食品安全問題提供了有效途徑，但其保鮮能力還需進一步研究。