基于iap 基因的RT-LAMP 技術檢測肉類食品中單核細胞增生李斯特菌的效果評價

陳 東， 楊 逍， 宋達峰*

（1.杭州安旭生物科技股份有限公司， 浙江 杭州 310000；2.浙江工商大學 食品與生物工程學院， 浙江 杭州 310000）

核細胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）是一種人畜共患病原菌，也被稱為高致病性兼容細胞有機體[1]，被其污染的食物可導致人類感染[2]。 在美國每年有1 600 多人感染該病菌，200 多人死亡[1]。 20世紀90 年代，WHO 將單增李斯特菌列為食品四大病原菌之一。 單核細胞增生李斯特菌可突破血腦屏障或是胎盤屏障，有極大的可能性會感染宿主中樞神經，這也是高死亡率（20%～30%）的主要原因[3-5]。目前國標檢測常用生化鑒定法， 該方法步驟煩瑣、檢測周期長、特異性低，無法做到快速靈敏檢測[6]，在市場檢測中實用性差， 酶聯熒光分析法（ELISA）則不夠準確高效。 到目前為止，由于食品形態和成分的多樣，單一配方的培養基無法適用于所有類型食物樣品中單增李斯特菌的分離， 需分門別類培養，操作非常不方便。 而逆轉錄環介導等溫擴增法（RT-LAMP）則可以很好地解決以上問題，既保留了逆轉錄檢測技術的高效精確，又結合了環介導等溫擴增法（LAMP）的簡便操作，該方法可同時檢測多批樣本，成本較低，結果判定簡單。 作者首次采用RT-LAMP 技術對8 株單增李斯特菌和33 株非單增李斯特菌進行特異性試驗，研究不同條件下對單增李斯特菌的iap 基因的檢測效果， 此外還探討了死菌附著于樣本對檢測結果準確性的影響。 本實驗以國家標準檢測法為對照， 以確認RT-LAMP 的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌種

分析了來自不同國家和來源的39 種細菌菌株，見表1。

表1 RT-LAMP 實驗菌株Table 1 RT-LAMP experimental strains

1.2 主要試劑

AMV 逆轉錄試劑、 細菌總RNA 快速抽提試劑盒、LAMP 引物及PCR 引物：上海生工生物工程科技有限公司；DNA 提取試劑盒：Axygen 公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計在GeneBank 中查找單核細胞增生李斯特菌的iap 基因的基因序列， 用Primer Explorer V4（Eiken Chemical，Japan）設計了4 個引物，包括2 個外引物（LM-F3 和LM-B3）和2 個內引物（LM-FIP 和LM-BIP），它們識別了iap 基因的6個區域，見圖1。

圖1 iap 基因引物在單核細胞增生李斯特菌中的位置和序列Fig.1 Location and sequence of iap gene primers in Listeria monocytogenes

1.3.2 DNA 和總RNA 的提取按照細菌總RNA快速抽提試劑盒（Sangon Biotech）和DNA 提取試劑盒（Axygen） 的操作說明分別提取DNA 和總RNA保存備用。

1.3.3 優化RT-LAMP 體系根據裴靈芝的RTLAMP 研究[7]，進行微調后設定RT-LAMP 初始的基本反應體系(25 μL)為：緩沖液1×ThermoPol?，dNTPs 0.8 mmol/L，MgSO42.0 mmol/L，LM-FIP 0.8 μmol/L，LM-BIP 0.8 μmol/L，LM-F3 0.4 μmol/L，LM-B3 0.4 μmol/L，AMV 逆轉錄酶10 U/μL， 甜菜堿1.0 mol/L，Bst DNA 聚合酶320 U/mL，RNA 2 μL，63 ℃孵育1 h。 用控制單一變量的方法對甜菜堿（0、0.5、1.0、1.5 mol/L），MgSO4（1.0、2.0、3.0、4.0 mmol/L），dNTPs（1.2、1.6、2.0、2.4 mmol/L）和Bst DNA 聚合酶（40、80、160、320 U/mL）和引物的孵育溫度（59、61、63、65 ℃）進行優化。

1.3.4 RT-LAMP 的特異性實驗用8 株單核細胞增生李斯特菌和31 株非單核細胞增生李斯特菌菌株按照試劑盒說明提取RNA， 用最優的RT-LAMP體系進行實驗， 觀察凝膠電泳結果來判斷RTLAMP 的特異性。

1.3.5 RT-LAMP 的靈敏度實驗用純單核細胞增生李斯特菌培養物(J0161)測定RT-LAMP 靈敏度。10 倍稀釋法處理培養物，從中提取RNA，并在最佳反應條件下進行RT-LAMP。 用上述方法按照試劑盒說明提取DNA 并測試LAMP 的靈敏度， 將瓊脂糖凝膠電泳結果與RT-LAMP 進行比較。

1.3.6 用RT-LAMP 和LAMP 檢測活菌和死菌作者測試了當地市場購買的50 個肉類樣品， 以確定RT-LAMP 是否能有效區分死細菌和活細菌。 將每個肉類樣品勻漿后，用105CFU/dL 的單增李斯特菌感染40 個肉樣品， 并將等濃度滅活菌液接種于剩余10 個肉類樣品。 將每種培養物振蕩培養后，離心取上清液提取DNA 和RNA， 分別用LAMP 和RT-LAMP 進行實驗并分析結果。

1.3.7 檢測肉樣中的單核細胞增生李斯特菌將RT-LAMP 檢測法和中國國家標準GB 4789.30—2016 法分別用于分析從中國當地市場獲得的100個肉樣品， 以確定RT-LAMP 鑒定肉中單核細胞增生李斯特菌的能力。 取每種肉類樣品勻漿，離心并從上清液中提取RNA。采用國家標準GB 4789.30—2016 檢測每種肉類樣品，已證實了單核細胞增生李斯特菌菌落的存在。

2 結果與分析

2.1 引物設計

引物序列見表2。設計了4 個引物，包括2 個外引物（LM-F3 和LM-B3）和2 個內引物（LM-FIP 和LM-BIP），它們識別了iap 基因的6 個區域，見表2。

表2 iap 基因的特異性引物序列Table 2 Specific primer sequences of iap gene

2.2 優化RT-LAMP 體系

優化RT-LAMP 實驗結果見圖2。 在MgSO4濃度為2.0 mmol/L 時可以擴增iap， 而在其他濃度下不產生擴增產物。 隨著dNTPs 濃度的增加，瓊脂糖凝膠上的RT-LAMP 產物條帶強度增加， 在dNTPs濃度為2.0 mmol/L 時觀察到最佳條帶。 添加1.0 mol/L 甜菜堿后，條帶檢測更清晰，但當甜菜堿濃度從1.0 mol/L 增加到1.5 mol/L 時沒有觀察到明顯的差異； 隨著反應體系中Bst DNA 聚合酶濃度的增加， 擴增產物在320 U/mL Bst DNA 聚合酶下觀察到最佳擴增。 模板在59～65 ℃成功擴增，并且在63℃產生最明顯的條帶。 基于這些結果，RT-LAMP 測定條件為：MgSO42.0 mmol/L，dNTPs 2.0 mmol/L，甜菜堿1.0 mol/L，Bst DNA 聚合酶320 U/mL， 擴增溫度63 ℃。 這些參數用作所有后續實驗的標準條件。

圖2 RT-LAMP 體系優化結果Fig.2 Optimization results of RT-LAMP system

2.3 RT-LAMP 的特異性試驗

設計的引物擴增了來自8 個單增李斯特菌菌株的iap 基因， 但沒有擴增來自非單增李斯特菌的iap 序列。 因此，RT-LAMP 試驗特異性地檢測單增李斯特菌，沒有假陽性結果，見圖3。

圖3 RT-LAMP 特異性結果Fig.3 RT-LAMP specific results

2.4 RT-LAMP 的靈敏度試驗

從單核細胞增生李斯特菌純培養物的5 個連續稀釋液中提取RNA（稀釋10 倍），在最佳反應條件下進行RT-LAMP 檢測。 在2 g/dL 瓊脂糖凝膠上觀察， 低于7.3×101CFU/mL 時沒有明顯的擴增產物，見圖4（a）。 比較LAMP 和RT-LAMP 的靈敏度，LAMP 的 靈 敏 度 為1.4×102CFU/mL， 低 于RTLAMP，見圖4（b）。

圖4 RT-LAMP 和LAMP 靈敏度結果Fig.4 Sensitivity results of RT-LAMP and LAMP

2.5 活菌和死菌的RT-LAMP 和LAMP 檢測

RT-LAMP 的測定結果見表3。在含有死單增李斯特菌的10 個樣品中結果為陰性， 但在LAMP 測試的所有10 個樣品中均為陽性， 而活菌污染樣本則均被檢出陽性。

表3 RT-LAMP 和LAMP 檢測死菌和活菌Table 3 Detection of dead and living bacteria using RTLAMP and LAMP

2.6 肉樣中存活的單核細胞增生李斯特菌檢測

100 個肉樣品RT-LAMP 分析數據與國家標準GB4789.30—2016 的數據比較結果見表4。 RTLAMP 和GB 測定均鑒定出3 種單核細胞增生李斯特菌陽性樣品，證實了RT-LAMP 測定的準確性。

表4 RT-LAMP 和GB 法檢測肉樣中的單核細胞增生李斯特菌Table 4 Detection of Listeria monocytogenes in meat samples using RT-LAMP and GB methods

3 結 語

作者首次用RT-LAMP 以iap 基因為靶基因設計引物檢測肉樣中單增李斯特菌， 在傳統的LAMP技術上作了延伸。此外，根據RT-LAMP 原理對反應體系進行優化，對該方法性能進行評估，并與國標進行對比。 實驗結果表明，RT-LAMP 在7.3×101CFU/mL 培養物中即可檢出單增李斯特菌， 具有高靈敏度。 且在特異性實驗中沒有出現假陽性結果，特異性強。 采用RT-LAMP 在7.3×101CFU/mL 的培養物中檢測到單增李斯特菌， 靈敏度是LAMP 的2倍。 在活菌和死菌的檢測實驗中，與LAMP 技術相比，RT-LAMP 只對活菌進行擴增，可以區分活細菌和死細菌， 避免假陽性結果， 且鑒別能力較強，而GB 方法難以做到。 在隨后的可行性實驗中，RTLAMP 檢測結果與國家標準GB 4789.30—2016 方法相同，但整體準確度更高，這表明它可以更快、更準確地檢測單增李斯特菌，有望取代GB 4789.30—2016。實驗結果還顯示，MgSO4的濃度對引物結合和Bst 活性的影響最大， 鎂離子的濃度不適合整個體系就不會得到擴增結果，這與之前的研究結果一致[8]。同時甜菜堿在體系中的作用值得探討，雖然其他人報道在RT-LAMP 中加入甜菜堿只能適度提高反應性能[9]，但在本實驗中觀察到擴增產物明顯增加（1.0 mol/L 甜菜堿是最佳）。 這一現象可能與甜菜堿增強RNA 對Bst DNA 聚合酶的易接近能力有關[10]。

綜上所述，RT-LAMP 技術檢測肉樣中單增李斯特菌具有特異性和良好的靈敏度， 相比GB 方法對死菌活菌的辨別準確，避免了消毒滅菌后死菌殘留或因其他原因出現死菌情況下對食品衛生程度的誤判[11-13]。 相比于傳統生化方法，此技術節省了菌落培養分離所需的時間，減少了工作量，并能做到即取即測。 同時該技術延續了LAMP 技術的優點，儀器成本低且操作便捷，為食源性致病菌的快速高效檢測提供了新途徑。