大腸桿菌生物膜關鍵組分缺失對細胞性能的影響

喬 君， 宮登科， 劉格爾， 陳玲嫣， 伍圓明，詹 依， 郭 勇， 孟祥宇， 王小元*,2,

（1.食品科學與資源挖掘全國重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 國際食品安全聯合實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 生物工程學院 江蘇 無錫 214122）

大腸桿菌生物膜由多糖、脂質、蛋白質、胞外DNA、蛋白質等組成[1-4]。 生物膜在維持結構完整性和剛性[5-7]、保護菌株免受不利環境影響[8-11]以及促進細菌和宿主細胞[12-13]之間的相互作用等方面至關重要。 但是，一些生物生物膜組分可對工業生產造成潛在的不利影響。 例如在食品工業中，生物膜會增加產品變質或被病原微生物群污染的風險[14]；在醫療領域，植入物或針管上的生物膜會引起患者嚴重感染[15]。此外，含有生物膜的病原菌會導致抗生素耐藥，形成休眠細胞，增加治愈難度和感染風險[16]。 對于工業發酵行業而言，生物膜的形成會消耗一定的底物和能源，而這些底物和能源本可以更好地促進細胞生長。 其次，生物膜會阻礙營養物質的吸收，導致菌體營養受限或生長緩慢。 最后，生物膜可介導生物污垢的形成，從而減少設備傳熱，增加腐蝕，縮短發酵設備的使用壽命[17-19]。

菌毛、鞭毛和卷曲纖維是存在于細胞表面的大分子蛋白質附屬物，菌毛在生物膜的形成、附著、侵襲和細胞運動等方面發揮著重要的作用[20-21]。 卷曲纖維也介導細胞間黏附和侵襲，促使菌落在宿主體內定植，增加致病風險[7]。 卷曲纖維由csGBAgDEFG操縱子編碼合成[13，22-23]。鞭毛是另外一種存在于大腸桿菌生物膜上的大分子蛋白質附屬物，在生物膜的合成、運動性和趨化性中發揮作用[24]。鞭毛的合成和組裝由4 個基因簇，共50 個基因的參與[25-27]，分別為flhEABcheZYBRtaptarcheWAmotBCflhCD、 fliYZACD ST、fliEFGHIJKLMNOPQR、flgNMQBCDEFGHIJKL。

大腸桿菌的非必需生物膜組分中，除含有上述蛋白質類附屬物外，還包含大量不同種類的胞外多糖。 纖維素是自然界中發現的最豐富的有機聚合物，細菌通常產生纖維素作為細胞外成分，用于機械和化學保護， 細菌纖維素由9 個基因編碼合成bcsGFEyhjRQbcsABZC 。 唾液酸是單體以獨特的α-（2，8）和（或）α-（2，9）鍵連接的直鏈聚合物，具有促進嬰幼兒神經系統發育的作用。 唾液酸由6 個基因簇編碼合成nanRATEKyhcH。 克拉酸又稱M-抗原，是由腸道細菌產生的具有高質量分數的L-巖藻糖（約30%）的胞外多糖。 據報道，由腸道微生物產生的克拉酸可以延長宿主的壽命，具有延緩衰老的作用[28-31]，克拉酸在食品、化妝品和醫藥等領域具有廣闊的應用前景。 脂多糖是微生物產生的強力毒素，由類脂A、核心多糖和O-抗原組成[32-34]。 在大腸桿菌中，類脂A 是必需組分，核心多糖和O-抗原是非必需生物膜組分， 去除核心多糖和O-抗原能夠起到減毒效果。 核心多糖由14 個基因參與合成waaDFCQGPSBORYZUL[34]。 O-抗原由11 個基因參與合成操縱子rfbBDACXglfwbbHIJKL[35]。 腸桿菌共同抗原（ECA）位于許多腸致病菌外膜，是一種由3個氨基糖重復單元組成的碳水化合物抗原[33]。 4 型莢膜是大腸桿菌的表面保護組分，可偶聯于膜蛋白質表面，為菌體提供物理、化學壓力保護，在菌體與環境間的相互作用中發揮重要作用。 4 型莢膜主要由7 個基因簇合成ymcDCBAyccZetpyccC[36-37]。 聚-β-1，6-N-乙酰葡萄糖胺是一種新發現的胞外多糖，是主要的生物膜黏附素，對生物膜的產生及維持其完整性起著重要作用。 聚-β-1，6-N-乙酰葡萄糖胺由4 個基因編碼合成pgaABCD[38]。

聚羥基丁酸酯（PHB）是微生物為儲存過量碳合成的生物大分子，其在細胞內形成不溶的球形內含物或顆粒[39-41]。 PHB 具有生物降解性、生物相容性、壓電性等性質，在生物降解塑料、組織工程支架等領域有廣泛的應用[42-43]。

為考察去除大腸桿菌非必需生物膜組分對菌株生長和產物合成效率造成的影響，作者首先篩選出大腸桿菌MG1655 中非必需生物膜組分，再采用Crispr-Cas9 基因編輯技術敲除MG1655 基因組中各生物膜組分的合成基因簇，構建了缺失不同生物膜組分的突變菌株，并考察其生長和表型變化。 鑒于微生物具有儲存過量碳合成PHB 的特性，作者以含有PHB 合成關鍵基因的質粒pBHR68 為探針，考察去除大腸桿菌的非必需生物膜組分能否節約底物和能源。 作者所在實驗室經前期研究發現，通過去除大腸桿菌菌毛和ECA 可以有效減少碳源消耗，提高細菌生長速度， 并顯著提高PHA 和L-蘇氨酸產量。 因此，作者進一步對大腸桿菌MG1655 中其他非必需生物膜組分進行研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑卡那霉素、氨芐西林、壯觀霉素、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）：西格瑪-奧德里奇（上海）貿易有限公司；DNA 聚合酶：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；質粒提取試劑盒和基因組提取試劑盒： 上海生工生物工程有限公司；PCR 產物純化試劑盒和凝膠純化試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；其他均購自中國醫藥集團有限公司。

1.1.2 主要儀器設備PCR 儀（ETC-811）：廣州東盛生物科技有限公司；核酸蛋白質定量儀（Nanodrop 2000）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；紫外分光光度計（UV-1800PC）：上海美譜達股份有限公司；水平核酸電泳儀（DYCP-31DN）：北京六一股份有限公司；電轉儀（Micro Pulser）：美國伯樂股份有限公司；酶標儀（Cytation 5）：美國伯騰股份有限公司；熒光分光光度計（Hitachi）：日本日立公司。

1.2 菌株、質粒和引物

本研究所用菌株、質粒及其遺傳特性見表1。所用引物序列見表2， 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 本實驗中所用菌株、質粒及特性Table 1 Strains and plasmids used in this study and their characteristics

表2 本實驗中用到的引物Table 2 All primers used in this study

1.3 培養基及培養條件

1.3.1 培養基 在LB 培養基、M9 培養基和PHB發酵培養基中加入卡那霉素（50 mg/L）、 壯觀霉素（50 mg/L）或氨芐青霉素（100 mg/L），維持篩選壓力。

1.3.2 培養條件PHB 發酵條件參見文獻[44]。

1.4 生長曲線測定

活化的大腸桿菌菌株分別接入LB 和M9 培養基中，于37 ℃、200 r/min 培養，每隔2 h 取樣測定OD600，直至OD600基本穩定。

1.5 質粒、突變株和PHB 生產菌株的構建

1.5.1 質粒的構建基因敲除中以pTargetF 為模板構建pTargetF013-025 系列質粒。 以pTargetF013 為例， 使用引物TF-013-F/TF-013-R 反向PCR 擴增獲得質粒片段，再用凝膠純化試劑盒純化。 純化后的質粒片段用T4 DNA 連接酶連接，將其轉入大腸桿菌Turbo 感受態細胞，37 ℃復蘇1 h 后涂布壯觀霉素抗性平板，用T-013-F/T-R 引物篩選菌落并測序驗證質粒正確性。 其他敲除質粒采用相同的方法和對應的質粒構建。

1.5.2 突變菌株的構建采用Crispr-Cas9 雙質粒無痕基因編輯技術敲除大腸桿菌MG1655 基因組中的相關基因簇，該方法需要包含pTargetF 系列質粒和供體DNA。 pTargetF 系列質粒構建如1.5.1 所述， 供體DNA 的獲得以WQM013 的構建為例進行詳細說明。 以大腸桿菌MG1655 基因組為模板，分別用引物對F1-013/R1-013 和F2-013/R2-013 擴增獲得上下游同源臂片段。獲得的產物經DNA 純化回收試劑盒純化后， 以該上下游同源臂片段為模板，用引物F1-013/R2-013 重疊PCR，再利用DNA純化回收試劑盒純化后，即得到供體DNA。 將供體DNA（400 ng）和pTargetF013（100 ng）混合后電轉入MG1655/pCas 感受態細胞中。 復蘇后涂布于含有卡那霉素和壯觀霉素的平板，在30 ℃下培養48 h，用引物F1-013/R2-013 挑選突變株，并測序驗證其正確性。 其他突變株使用相同的方法構建。

1.5.3 PHB 生產菌株的構建將攜帶基因PHB 合成關鍵基因phaCAB 的pBHR68 質粒電轉到野生型MG1655 和 突 變 株 WQM013 -020、WQM022G、WQM023-025 中，用引物T-PHB-F 和T-PHB-R 驗證正確性。

1.6 鏡檢及膜通透性

1.6.1 結晶紫染色大腸桿菌細胞固定后，加入質量分數1%結晶紫靜置30 s，無菌水沖洗后晾干，在光學顯微鏡下觀察菌體形態。

1.6.2 胞外多糖染色采用單寧媒染染色法進行胞外多糖染色[29]。大腸桿菌細胞在LB 和M9 固體培養基上培養24 h， 挑取單菌落并固定在載玻片上，加入品紅溶液（0.3 mL 品紅堿、90 mL 體積分數5%苯酚、10 mL 體積分數95%乙醇）染色3 min，無菌水沖洗后加媒染液（2 g/L 硫酸鋁鉀飽和溶液、0.3 g/L FeCl3、1.5 g/L 單寧體積比為5∶2∶3）染色3 h，無菌水沖洗后用質量分數1%亞甲藍處理30 s， 無菌水沖洗晾干后在油鏡下觀察樣品。

1.6.3 膜通透性檢測膜通透性評價采用N-苯基-α-萘胺（NPN）法[29，32]。 細胞培養12 h 后，收集菌體并洗滌2 次， 菌體重懸于1.92 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）中。 細胞懸液中加入1 mmol/L NPN，使菌體濃度OD600為0.5，然后用熒光分光光度計測定熒光強度（激發和發射波長分別為350 nm 和420 nm）。

1.7 PHB 定量分析

使用尼羅紅染色法對產PHB 菌株進行高通量篩選，PHB 發酵結束后，離心收集菌體，加入TSE 蔗糖緩沖液 （10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.5，20 g/dL 蔗糖溶液，2.5 mmol/L Na-EDTA 溶液）， 使其OD600為0.4，冰上孵育10 min，離心收集菌體，用1 mmol/L氯化鎂溶液重懸至相同菌體濃度。 將3 μL 尼羅紅溶液（1 mg/mL DMSO 溶解）添加到1 mL 細胞懸液中，混勻后在37 ℃避光孵育30 min，立即用酶標儀在37 ℃下檢測熒光強度，激發波長為485 nm，發射波長為565 nm。

1.8 基因轉錄分析

全轉錄組分析按已報道的方法執行[29]。 大腸桿菌MG1655 和WQM018 分別培養至對數中期，4℃、12 000 r/min 收集菌體， 磷酸緩沖液洗滌2 次后用液氮速凍。 大腸桿菌MG1655 基因組用于序列讀取、比對和分析。RNA 文庫的提取、構建和測序委托蘇州金唯智生物技術公司操作。 原始轉錄組序列數據已上傳到NCBI Sequence Read Archive 數據庫（SRA），項目序號為PRJNA603230。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌非必需生物膜組分篩選及突變株的構建

為了考察去除非必需生物膜組分對菌株生長和表型產生的影響，作者選擇大腸桿菌MG1655 模式菌株為研究對象。 首先查閱比對大腸桿菌MG1655 基因組， 篩選出非必需生物膜組分11 個，分別是：菌毛、鞭毛、卷曲纖維、核心多糖、O-抗原、克拉酸、腸桿菌共同抗原、4 型莢膜、纖維素、唾液酸和聚-β-1，6-N-乙酰葡萄糖胺。 其中，菌毛、鞭毛和卷曲纖維屬于大分子蛋白質聚合物類，其他8 種屬于胞外多糖類。 前期研究發現，去除大腸桿菌菌毛和ECA 可以促進菌株生長并提高生產效率[44]。 因此，作者分別敲除鞭毛、卷曲纖維、核心多糖、O-抗原、克拉酸、4 型莢膜、纖維素、唾液酸和聚-β-1，6-N-乙酰葡萄糖胺的11 個操縱子， 構建出突變株WQM013、WQM014、WQM015、WQM016、WQM017、WQM018、WQM019、WQM020、WQM022G、WQM023、WQM024 和WQM025，見圖1。

圖1 大腸桿菌MG1655 的非必需生物膜組分Fig.1 Non-essential biofilm components in E.coli MG1655

2.2 非必須生物膜組分缺失突變株的生長改變

11 個突變菌株分別在富營養的LB 培養基和營養缺乏的M9 培養基中培養，其生長曲線見圖2。 在LB 培 養 基 中，WQM018、WQM019、WQM020 和WQM023 的生長速度和生物量不及對照菌株MG1655，涉及的組分為核心多糖、O-抗原、克拉酸和纖維素， 說明這4 種組分對菌株的生長至關重要，去除它們可能會造成生物膜變薄或破損，對菌株產生不利影響。 其他突變株的生長與對照菌株相當，這可能是由于LB 培養基中的營養比較豐富，不能明顯體現出去除生物膜組分可節約能源和底物及對菌株的促進效果。 在M9 培養基中，WQM013、WQM014、WQM016 和WQM024 生長速度和生物量明顯優于對照菌株，涉及組分鞭毛和唾液酸，這可能是由于M9 培養基（基礎培養基）營養匱乏，細菌需要通過自身先合成必需氨基酸或其他關鍵物質用于鞭毛或唾液酸合成， 而去除鞭毛或唾液酸后，細胞可以節約底物和能源用于生長。

圖2 突變株在LB 和M9 培養基中生長曲線Fig.2 Growth curves of mutants cultured in LB and M9 medium

2.3 缺失大腸桿菌非必需生物膜組分對膜通透性的影響

大腸桿菌非必需生物膜組分位于細胞外膜和周質空間， 它們的缺失會導致生物膜厚度的改變，進而改變膜通透性。 有研究表明，敲除ECA 相關基因后，大腸桿菌膜通透性顯著提高[44]。 如圖3 所示，突 變 株 WQM013、WQM014、WQM015、WQM016、WQM018、WQM020 和WQM024 通透性增加， 尤其突變株WQM018 膜通透性比對照株提高了近40%。而WQM013、WQM014、WQM015 和WQM016 均 屬于鞭毛缺失突變株，后續實驗可以考察4 個鞭毛基因簇全部敲除后膜通透性的變化。 此外，敲除克拉酸和唾液酸基因簇也能顯著增加膜通透性，這會更有利于營養物質的吸收以及發酵產物的外排，減少致病菌的耐藥性和致病風險。

圖3 大腸桿菌非必需生物膜組分缺失突變株的膜通透性Fig.3 Membrane permeability of E.coli mutants lacking non-essential biofilm components

2.4 大腸桿菌非必需生物膜組分缺失對PHB 合成的影響

將含有PHB 合成關鍵基因phaCAB 的pBHR68質粒分別導入對照菌株MG1655 和各突變株，構建了重組菌株MG1655/pBHR68、WQM013-020/pBHR68、WQM022G/pBHR68、WQM023-025/pBHR68。如圖4 所示， 所有含有pBSK 空載質粒的菌株不能合成PHB，當轉入PHB 合成質粒后，PHB 產量明顯增加。 所有突變株在LBG 培養基中PHB 的產量與對照菌株相當，產量較低。在M9G 培養基中，WQM015/pBHR68、WQM018/pBHR68、WQM019/pBHR68、WQM020/pBHR68、WQM022G/pBHR68、WQM023/pBHR68、WQM024/pBHR6-8、WQM025/pBHR68 的PHB 產量較野生型有所提高， 其中WQM018/pBHR68 的PHB 產量最高， 比對照菌株提高了35.32%。通過顯微鏡觀察，可以看到突變株WQM015/pBHR68、WQM018/pBHR68、WQM019/pBHR68、WQM020/pBHR68、WQM022G/pBHR68、WQM023/pBHR68、WQM024/pBHR68、WQM025/pBHR68 菌體變長變粗， 胞內產生白色PHB 顆粒， 而對照菌株MG1655/pBHR68 為肉眼不可見白色PHB 顆粒，見圖5。 此外，8 個產PHB 突變株中， 除W-QM015/pBHR68 為鞭毛突變株外， 其他均為胞外多糖突變株。 初步判定去除核心多糖、O-抗原、克拉酸、4 型莢膜、纖維素、唾液酸和聚-β-1，6-葡萄萄糖胺后，可以節約能源和底物，用于PHB 合成。

圖4 含有PHB 生產質粒的突變株產PHB 能力分析Fig.4 Analysis of PHB production ability of mutants containing PHB-producing plasmid

圖5 鏡檢觀察M9G 培養基中的PHB 合成菌株Fig.5 Microscopic observation of PHB-producing strains in M9G medium

2.5 核心多糖缺失對克拉酸合成的影響

作者在構建非必需生物膜組分缺失的突變株時，發現敲除核心多糖的WQM018 突變株在平板上能長出黏液狀菌落。 進一步對其產生條件和種類進行初步分析發現， 對照株MG1655 在37 ℃培養時，無論是在LB 還是M9 培養基培養都不產生黏液狀菌落，胞外多糖染色視野中看不到媒染的藍色胞外多糖；而WQM018 在M9 培養基中，菌落略顯黏稠，鏡檢視野有少量藍色媒染的胞外多糖。 在30 ℃培養時，MG1655 在M9 平板上的菌落略顯黏稠，染色后視野微藍， 而WQM018 在LB 和M9 培養基中均能長出明顯的黏液狀菌落，鏡檢視野中含有大量的媒染的藍色胞外多糖，見圖6。

圖6 MG1655 和WQM018 產胞外多糖觀察Fig.6 Observation of exopolysaccharides produced by MG1655 and WQM018

從鏡檢圖片可以看出，WQM018 產生了大量的胞外多糖。為推斷所產胞外多糖的種類，以MG1655為對照，對WQM018 的轉錄水平進行考察。 從圖7可以看出，所有與克拉酸合成和組裝相關的基因大幅上調， 推斷WQM018 產生的胞外多糖為克拉酸，這與文獻報道的截短核心多糖促進克拉酸合成相符[29]。此外，卷曲纖維及菌毛合成的相關基因顯著下調，見圖8。 結合WQM018 的膜通透性明顯增強的結果， 推測促進克拉酸合成的原因為： 大腸桿菌MG1655 去除核心多糖后，突變株WQM018 膜通透性增強，導致WQM018 合成大量的克拉酸以維持適當的胞內滲透壓。 胞外大量克拉酸的積累和分泌又導致了菌毛及卷曲纖維合成的減少。 至于為何產生克拉酸維持滲透壓， 不是其他種類的胞外多糖，還需深入研究。

圖7 WQM018 中克拉酸合成基因的轉錄水平Fig.7 Transcriptional levels of genes related to colanicacid biosynthesis in WQM018

圖8 WQM018 中卷曲纖維和菌毛合成基因的轉錄水平Fig.8 Transcriptional levels of genes related to curl and fimbriae biosynthesis in WQM018

3 結 語

大腸桿菌因其具有清晰的遺傳背景和寬松的培養條件常被作為模式菌株，廣泛應用于生物工程和工業微生物的研究中。 與此同時，大腸桿菌具有復雜且種類繁多的生物膜組分，這些組分在菌體趨化性、 抵御外界壓力和侵染等方面發揮著重要作用。 但是在發酵工業中，這些生物膜組分的合成和組裝需要耗費大量的能源和底物，而且某些生物膜組分還存在巨大的安全隱患。

作者以提高菌株優良性能并減少致病風險為出發點， 匯總了大腸桿菌生物膜的11 種非必需生物膜組分， 從基因水平分別去除這些生物膜組分，考察其生長、膜通透性、節約碳源和重塑代謝等方面的變化。 整體而言，突變株在LB 培養基中表現出抑制生長或變化不明顯。敲除鞭毛fliE-R、fliY-T 和flhE-D 基 因 簇， 構 建 的WQM013、WQM014 和WQM016 在M9 培養基中生長優于對照菌株。 敲除鞭毛基因簇flgN-L，構建的突變株WQM015 生長變差，但有利于PHB 合成。 分別敲除鞭毛的4 個基因簇后，通透性都得到增強，因此應深入研究組合敲除鞭毛4 個基因簇的突變株。 去除胞外多糖類組分基本都能積累PHB 和增強菌株通透性，下一步應構建組合敲除菌株，進一步增強膜通透性和提高PHB產量。 但是，在所用胞外多糖組分中，僅敲除4 型莢膜、唾液酸和聚-β-1，6-葡萄糖胺能促進其在M9 培養基中的生長。 因此，應重點考察這3 種組分缺失的突變株及鞭毛突變株，進一步提高生長性能。 其次，去除大腸桿菌核心多糖能重塑代謝調控，促進克拉酸的生產。 這些結果為大腸桿菌非必需生物膜組分存在必要性的研究提供了理論依據，也為其他菌株的改造和發酵產物的產量提高提供了新思路。