不同貯藏條件下芹菜可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及相關(guān)基因變化分析

賈 敏， 朱勝琪， 王雅慧， 譚杉杉， 劉潔霞， 陶建平， 熊愛(ài)生*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095）

芹菜是傘形科一種重要的二年生綠葉菜類(lèi)[1-2]。芹菜富含維生素、膳食纖維、類(lèi)胡蘿卜素和芳香物質(zhì)等，具有良好的保健和藥用功效，生長(zhǎng)最適溫度為15～20 ℃[3-4]。 芹菜于漢代被引入我國(guó)，距今已栽培馴化2 000 多年，歷史悠久，品種繁多[5]。

可溶性糖作為調(diào)節(jié)植物體滲透壓的重要物質(zhì)之一，可以幫助植物抵抗許多脅迫因子[6-7]。 可溶性糖與環(huán)境因子比如溫度、光照等都有一定的關(guān)系[8]。研究表明，光照貯藏下芫荽和蕹菜葉片中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在貯藏期內(nèi)持續(xù)增加并高于同期的黑暗處理[9]。 甘薯可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨貯藏時(shí)間逐漸增加，其增加速度與貯藏溫度密切相關(guān)[10]。 低溫可以降低采后糯玉米可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降速度，且5 ℃時(shí)下降速度最慢[11]。糖代謝過(guò)程中涉及多種酶，其中蔗糖磷酸合酶 （sucrose phosphate synthase，SPS）在植物組織中廣泛存在。 SPS 催化6-磷酸果糖產(chǎn)生的6-磷酸葡萄糖經(jīng)蔗糖-6-磷酸磷酸酶（sucrose phosphate phosphatase，SPP）催化產(chǎn)生蔗糖。 研究發(fā)現(xiàn)，將玉米SPS 基因在煙草中過(guò)表達(dá)后，植株蔗糖含量明顯增加[12]。擬南芥的相關(guān)研究表明，SPSA1 和SPSA2 是擬南芥蜜腺分泌花蜜必不可少的基因[13]。作為植物中同化CO2形成蔗糖的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，SPS活力大小隨蔗糖積累量的增加而增大[14]。 在蔗糖分解為己糖的過(guò)程中， 參與的酶主要有蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS） 和 蔗 糖 轉(zhuǎn) 化 酶（sucrose invertase，IVR）。 其中SS 在植物代謝反應(yīng)中促使蔗糖合成為果糖， 多數(shù)植物中至少包含2 種SS 同工酶，它們?cè)诨蛘{(diào)控上差異明顯，并且具有發(fā)育情況和器官種類(lèi)的特異性。 IVR 的功能是催化蔗糖水解為其他糖類(lèi)，且此類(lèi)反應(yīng)通常被稱為一種不可逆的反應(yīng)[15]。 高媛媛等發(fā)現(xiàn)番茄葉片中的一個(gè)轉(zhuǎn)化酶基因可能參與番茄花蕾糖分代謝過(guò)程[16]。研究發(fā)現(xiàn)，溫州蜜柑和檸檬果實(shí)的蔗糖中性轉(zhuǎn)化酶活性隨著成熟逐漸降至最低[17-18]。 這些結(jié)果說(shuō)明，蔗糖轉(zhuǎn)化酶不僅參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，還對(duì)果實(shí)品質(zhì)有一定影響，是評(píng)價(jià)其風(fēng)味的一項(xiàng)重要指標(biāo)[19]。 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 （uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase，UDPG） 是形成蔗糖的物質(zhì)之一， 也參與合成酚類(lèi)物質(zhì)的C6-C3-C6骨架，二者互相影響對(duì)UDPG 的結(jié)合[20]。此外，多數(shù)UDPG 被消耗用來(lái)組成木質(zhì)素的碳骨架[21]。

作者選取‘四季小香芹’和‘六合黃心芹’為研究材料，‘四季小香芹’葉片鮮綠有光澤，葉柄顏色嫩綠且實(shí)心，具有早熟、抗病、商品性好、產(chǎn)量高等特點(diǎn)。 ‘六合黃心芹’為南京六合地區(qū)的優(yōu)良地方品種，葉柄黃綠色、空心、品質(zhì)高，心葉金黃色，具有晚熟、抗性強(qiáng)、適應(yīng)性好、產(chǎn)量較高等特點(diǎn)。 將其置于室溫（25 ℃）、低溫（4 ℃）和室溫黑暗（25 ℃）條件下， 測(cè)定貯藏至0、6、24、30、48、54 h 的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)可溶性糖代謝相關(guān)基因（AgIVR1、AgSPP、AgSPS、AgSS1 和AgUDPG）的表達(dá)水平，以期為提高芹菜采后品質(zhì)、科學(xué)貯藏芹菜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以南京及江蘇大部分地區(qū)主要種植的小芹菜品種‘四季小香芹’和優(yōu)良地方品種‘六合黃心芹’為試驗(yàn)材料，挑選大小一致的種子，浸種催芽，播到裝有基質(zhì)的塑料盆中，生長(zhǎng)65 d 后進(jìn)行處理。 選取生長(zhǎng)狀況大致相同的芹菜分別置于室溫（25 ℃）、低溫（4 ℃）和室溫黑暗（25 ℃）條件下生長(zhǎng)，長(zhǎng)至0、6、24、30、48、54 h 時(shí)分別取樣。 取樣部位為葉片和葉柄，一部分用于葉綠素的測(cè)定，另一部分用于RNA的提取，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2 可溶性糖測(cè)定

可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照王學(xué)奎等的實(shí)驗(yàn)方法[22]。稱取樣品約0.5 g 溶解于體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇中，80 ℃水浴30 min，冷卻后離心，再次浸提。 取浸提液于沸水浴上蒸干，用蒸餾水重新溶解，離心后取上清液，測(cè)其在620 nm 的吸光度。

1.3 總RNA 提取及cDNA 的合成

參照RNA Simple Total RNA Kit （Tiangen，北京） 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA， 并按照Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa，大連）試劑盒說(shuō)明書(shū)將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)芹菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得芹菜可溶性糖代謝通路相關(guān)基因[23-24]。 利用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)芹菜可溶性糖代謝通路相關(guān)基因的特異性正反引物。 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。 引物序列分別為AgIVR1-F：5′-ACGGTTCTCA GCAAGTTC-3′；AgIVR1-R：5′-CAGATGGAGTTAT CACAATGG-3′。 AgSPP-F：5′-CTTGCTTGCCTCCA CTAA-3′；AgSPP-R：5′-GCCTATGCTAACACCTGA T-3′。 AgSPS-F：5′-TCATCATCATCATCGTCAGT-3′；AgSPS-R：5′-GTCAAGTAGCATATCCTAAGC-3′ 。AgSS1-F：5′-CCACAGTATTCTTCGTTCCT-3′ ；AgSS1-R：5′-ATTCTGCGTGTTCCATTCA-3′ 。AgUDPG-F：5′-GAAGGAACATCTACGAGGAA-3′；AgUDPG-R：5′-ACACCACAGCCATTCTTG-3′。內(nèi)參基 因 為 actin， 引 物 序 列 為 Agactin -F：5′ -CTTCCTGCCATATATGATTGG-3′；Agactin-R：5′-GCCAGCACCTCGATCTTCATG-3′[25]。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 參照SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa，大連）說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)在Bio-Rad 熒光定量PCR 儀CFX96 上進(jìn)行。 PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照賈麗麗等的實(shí)驗(yàn)步驟[26]，用Excel 2010和SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏條件對(duì)芹菜可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

如圖1 所示， 以貯藏0 h 的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為對(duì)照，‘四季小香芹’葉片和葉柄中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨貯藏時(shí)間的增加上下波動(dòng)。 室溫黑暗條件下，葉片中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終高于低溫和室溫貯藏條件。 除貯藏后30 h，室溫黑暗條件下芹菜葉柄中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于另兩種貯藏條件。 室溫與低溫條件相比，前者葉片中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本高于后者，但差異不顯著。 貯藏后24、30、54 h時(shí)，低溫條件下葉柄中的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于室溫條件，差異不顯著。

圖1 不同貯藏條件下‘四季小香芹’可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.1 Soluble sugar mass fraction of ‘Sijixiaoxiangqin’ under different storage conditions

由圖2 可知，‘六合黃心芹’葉片和葉柄在低溫條件下貯藏30 h 時(shí)的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于室溫和室溫黑暗條件。 葉片和葉柄中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)也存在一定差異。 當(dāng)貯藏至54 h 時(shí)，3 種貯藏條件下可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著，在室溫黑暗條件下葉片中的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是低溫條件。貯藏至24 h 和54 h 時(shí)，在室溫條件下放置的芹菜中葉柄可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，與另兩種貯藏條件下的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著。

圖2 不同貯藏條件下‘六合黃心芹’可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.2 Soluble sugar mass fraction of ‘Liuhehuangxinqin’ under different storage conditions

2.2 ‘四季小香芹’葉片中可溶性糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

以‘四季小香芹’ 貯藏0 h 的基因表達(dá)量為對(duì)照，不同貯藏條件下葉片中可溶性糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平見(jiàn)圖3。AgIVR1 表達(dá)量隨時(shí)間的增加大體呈下降趨勢(shì)，貯藏后48 和54 h 較為明顯。室溫條件下，AgIVR1 在6 h 和54 h 表達(dá)量與其他貯藏條件相比均最低。 AgSPP 表達(dá)量隨時(shí)間的增加呈先下降后上升趨勢(shì)，低溫和室溫黑暗條件下的表達(dá)量相近， 均顯著高于室溫條件。 隨著貯藏時(shí)間的增加，AgSPS 表達(dá)量持續(xù)下降。 AgSS1 在室溫條件下貯藏6 h 的表達(dá)量最高；在室溫黑暗條件下，貯藏48 h 時(shí)其表達(dá)量顯著上調(diào)；低溫條件下貯藏54 h 時(shí)，表達(dá)量顯著上升。在整個(gè)貯藏過(guò)程中，AgUDPG 表達(dá)量整體先上升后下降。 在貯藏前期（6 h），室溫和低溫條件下AgUDPG 表達(dá)量上調(diào)明顯。 貯藏至54 h 時(shí)，低溫條件下AgUDPG 表達(dá)量顯著高于其他2 種貯藏條件。 在室溫黑暗下放置48 h 后，AgUDPG 基因近乎不表達(dá)。

圖3 ‘四季小香芹’葉片中可溶性糖代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of genes related to soluble sugar metabolism in the leaves of ‘Sijixiaoxiangqin’

2.3 ‘六合黃心芹’葉片中可溶性糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

以貯藏0 h 的基因表達(dá)量為對(duì)照， 不同貯藏條件下‘六合黃心芹’葉片中可溶性糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平見(jiàn)圖4。 隨著貯藏時(shí)間的增加，AgIVR1表達(dá)量上下波動(dòng)。 在貯藏后期（48 h 和54 h），低溫和室溫黑暗條件下AgIVR1 表達(dá)量較高。 整個(gè)貯藏過(guò)程中，3 種貯藏條件下AgSPP 基因的表達(dá)量基本都高于對(duì)照。 在貯藏后期，室溫條件下AgSPP 表達(dá)量上調(diào)明顯，與‘四季小香芹’相異。AgSPS 表達(dá)量隨貯藏時(shí)間的增加整體呈下降趨勢(shì)。 貯藏48 h 時(shí)，AgSPS 在室溫黑暗條件下表達(dá)量最高。 貯藏54 h時(shí)，3 種貯藏條件下AgSPS 表達(dá)量都極低，幾乎不表達(dá)。AgSS1 在室溫條件下貯藏至6 h 的表達(dá)量最高。在低溫條件下，隨著貯藏時(shí)間的增加，AgSS1 貯藏至54 h 的表達(dá)量顯著上調(diào)。 AgUDPG 在貯藏后期的室溫條件下表達(dá)量極低，幾乎不表達(dá)。 在貯藏后期，低溫和室溫黑暗條件下AgUDPG 表達(dá)量較高，且室溫黑暗條件下的表達(dá)量顯著高于低溫條件。

圖4 ‘六合黃心芹’葉片中可溶性糖代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of genes related to soluble sugar metabolism in the leaves of ‘Liuhehuangxinqin’

3 結(jié) 語(yǔ)

可溶性糖是蔬菜中一種重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其含量多少是影響果蔬采后品質(zhì)的重要因素[27]。 可溶性糖作為果實(shí)風(fēng)味的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一，其組分含量特征與果實(shí)風(fēng)味聯(lián)系緊密[28-29]。 蔬菜中可溶性糖包括葡萄糖、果糖和蔗糖等。 本研究中2 種芹菜葉柄可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于葉片，‘四季小香芹’可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于‘六合黃心芹’，芹菜中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在品種和組織差異性。 ‘四季小香芹’在室溫黑暗條件下，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本高于另兩種貯藏條件。 顧振新等在蕹菜和芫荽的貯藏試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，光照條件下植物體內(nèi)還原糖的含量高于同期的黑暗處理組[30]，這與本研究結(jié)果存在一定差異，可能與貯藏條件的光照強(qiáng)度和糖種類(lèi)有關(guān)。 本研究可溶性糖在不同溫度條件下無(wú)顯著變化。 彩葉草在（10±2）℃、（15±2） ℃、（20±2） ℃下可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化不明顯，這與本研究結(jié)果一致[31]。

作者選取的5 個(gè)關(guān)鍵基因在可溶性糖積累過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，SS 至關(guān)重要[32]。 研究表明，SS 能調(diào)控淀粉的生成，在玉米皺縮（sh1）突變體的蔗糖轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸鄣倪^(guò)程中，淀粉的含量受SS 活性正調(diào)控[33]。 有研究報(bào)道馬鈴薯的SS 活性被抑制時(shí)，植株中淀粉含量和總產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)[34]。 在本研究中，低溫貯藏至54 h 時(shí)，2 種芹菜AgSS1 的表達(dá)量都顯著上升，說(shuō)明AgSS1 可能在低溫貯藏的后期發(fā)揮作用。SPS 存在于植物各個(gè)部位，是蔗糖參與各種生化反應(yīng)的關(guān)鍵酶之一。 實(shí)驗(yàn)證明甘蔗莖中SPS 的活力與蔗糖的含量成正比[35]。 蔗糖的形成受SPS 的正調(diào)控，而蔗糖含量則隨淀粉的積累而減少[14]。 對(duì)網(wǎng)紋甜瓜而言，花后5～25 d 內(nèi)，SPS活性持續(xù)偏低，蔗糖積累極少，而花后30 d 后，SPS活性顯著增加，蔗糖積累呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[36]。在本研究中，不同貯藏條件下2 種芹菜的AgSPS 表達(dá)量整體都呈下降趨勢(shì)， 說(shuō)明在芹菜貯藏過(guò)程中可能由AgSPS 前期的大量表達(dá)來(lái)促進(jìn)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加。

隨貯藏時(shí)間的增加，本研究中3 種貯藏條件下‘四季小香芹’AgSPP 表達(dá)量基本都低于對(duì)照，而‘六合黃心芹’則都高于對(duì)照。 IVR 不僅與糖的代謝和轉(zhuǎn)化有關(guān)，還與植物的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。 研究發(fā)現(xiàn)，在4、10、15、20 ℃的貯藏溫度下，‘云薯105’馬鈴薯的蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)[37]。 研究發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜中反義酸性IVR的遺傳轉(zhuǎn)化使植株發(fā)生明顯的表型變化，且該變化出現(xiàn)在發(fā)育的早期階段[38]。‘四季小香芹’AgIVR1 表達(dá)量隨貯藏時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明‘四季小香芹’中AgIVR1 可能在貯藏前期發(fā)揮主要功能。作為蔗糖合成的底物，UDPG 在蔗糖合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 2 種芹菜的AgUDPG 在貯藏后期于室溫條件下表達(dá)量極低，幾乎不表達(dá)。

綜上所述， 在室溫黑暗條件下，‘四季小香芹’葉片和葉柄中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于低溫和室溫貯藏條件。 在低溫條件下，‘六合黃心芹’葉片和葉柄中總可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于室溫和室溫黑暗條件。 因此，在對(duì)可溶性糖要求較高的條件下，‘四季小香芹’宜在室溫黑暗條件下短期貯藏，‘六合黃心芹’宜在低溫條件下短期貯藏。 芹菜中可溶性糖積累量及可溶性糖代謝相關(guān)基因的功能存在多樣性，并且芹菜中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的積累涉及復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，單個(gè)基因表達(dá)量與可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間不一定存在直接聯(lián)系，不同基因之間可能通過(guò)互作共同調(diào)節(jié)芹菜貯藏過(guò)程中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，具體的作用機(jī)制需進(jìn)一步探究。