含鐵牛血肽改善大鼠缺鐵性貧血的效果評價

鮑正好， 王阿琴， 許月新， 劉菲菲， 余 鈞， 何紅鵬*

（1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.杭州佰倍優生物科技有限公司，浙江 杭州 310020；3.北京市門頭溝區醫院，北京 102300）

牛血是肉制品行業中一類重要的副產品，含有豐富的營養和多種生物活性物質，具有較好的開發利用前景。 牛血除了含有較高的蛋白質外，還含有鐵、鈉、鉀、鈣、鎂等礦物質[1-2]。 目前的畜產品加工現狀是畜血總體利用率不到總產量的30% ，其中牛血液由于血腥味較重、消化性和適口性差、色澤感觀不佳且原料血液在常溫下難以長期保存等因素，利用率更低[3]。 據報道，我國年產牛血可達到57.25 萬t，因此，對牛血的有效利用，可以減少牛制品加工過程中產生的浪費，充分發揮牛制品的經濟價值。

鐵是人體所必需的微量元素之一，參與線粒體中呼吸鏈電子傳遞、血紅蛋白和肌紅蛋白合成等生命活動，對于人體功能特別是骨髓造血功能至關重要[4]。 持續的鐵攝入量不足或慢性失血會導致機體缺鐵，骨髓內的紅細胞生成減少，血紅蛋白合成障礙，進而出現IDA（iron-deficiency anemia，IDA）的狀態，表現為小細胞低色素性貧血[5-6]。 IDA 目前仍然是全球面臨的主要公共衛生問題，2010 年全球性調查顯示，貧血影響了世界上三分之一的人口，而其中一半的病例是由于缺鐵所導致的[7]。 世界衛生組織綜合195 個國家的統計數據顯示，2016 年全球大約有12.4 億人口患有IDA[8]。由于兒童、青少年和婦女生理上對鐵需求增加而鐵攝入量減少或病理性吸收缺陷或慢性失血等因素， 使得兒童與婦女的IDA 發病率更高[9-11]。

目前治療IDA 廣泛推薦的方法是補鐵，主要采用口服與注射方式進行。 口服補鐵劑常見的有硫酸亞鐵片、 生血寧片和蛋白琥珀酸鐵口服溶液等，大多為非血紅素鐵。 為避免對胃腸道產生副作用，上述補鐵劑通常做成緩釋劑型，但鐵的緩慢釋放容易導致鐵的吸收率降低[12]。 另一種補鐵方式是靜脈注射，這種方式可有效避免一些患者對于口服補鐵劑的不耐受以及口服補鐵效果緩慢的缺點。 常用的靜脈補鐵劑有右旋糖酐鐵、羧基麥芽糖鐵及異麥芽糖酐鐵等[13-14]。 靜脈補鐵需要在醫護人員的專業操作下進行，相比之下，口服補鐵更加方便。

本研究旨在通過建立IDA 大鼠模型，評價口服含鐵牛血肽對IDA 的治療功效和胃腸道副作用，探索一種安全有效的新型口服補鐵劑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

含鐵牛血肽粉：多肽質量分數90.06%，鐵質量分數2.5 g/kg， 由杭州佰倍優生物科技有限公司提供；生血寧片：武漢聯合藥業有限責任公司；低鐵飼料（鐵質量分數2.873 mg/kg）、正常飼料（鐵質量分數51.9 mg/kg）：南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 實驗動物與飼養

3 周齡斷奶SPF 級雌性SD 大鼠， 由中國食品藥品檢定研究院提供， 實驗動物生產許可證號SCXK（京）2017-0005，喂養于不銹鋼鼠籠。 在籠底放置不銹鋼架子將大鼠架起以便將大鼠與糞便隔離。 實驗動物房溫度（23±3） ℃，濕度（50±10）%及光照12 h/12 h 光/暗循環條件下飼養大鼠。 實驗單位使用許可證編號為SYXK（津）2018-0001。

1.3 主要儀器與試劑

BC-5100 血液分析儀：邁瑞生物醫療電子股份（深圳）有限公司；UVmini-1240 可見光分光光度計：島津企業管理（中國）有限公司；SpectraMax190 全波長酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；血清鐵測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；大鼠鐵蛋白酶聯免疫檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.4 實驗方法

1.4.1 IDA 大鼠模型的建立購買 （50±10） g SPF級3 周齡初斷奶雌性SD 大鼠，隨機選取12 只大鼠作為對照飼料組，整個實驗過程中飼喂正常飼料和去離子水，其余大鼠則以低鐵飼料及去離子水喂養3 周，至血紅蛋白質質量濃度為60 g/L 左右。

1.4.2 大鼠恢復實驗造模成功后，按每組6 只隨機分為對照組、血肽低劑量組（0.8 g/（kg·d））、血肽中劑量組（2.4 g/（kg·d））、血肽高劑量組（6.4 g/（kg·d））和生血寧組（0.11 片/d）。 對照飼料組繼續以正常飼料和去離子水喂養，其他各組繼續以低鐵飼料及去離子水進行喂養。 各治療組每日上午9 時灌胃給藥，共5 周，對照飼料組與空白對照組則給予等量去離子水。 大鼠末次灌胃后禁食12 h，根據體質量腹腔注射3 g/dL 的戊巴比妥鈉， 劑量為0.2 mL/hg，大鼠麻醉后取腹主動脈血，然后取胃組織，最后大鼠尸體作為特殊垃圾進行無害化處理。

1.5 檢測指標

1.5.1 大鼠的一般情況給藥前后每周測一次體質量。

1.5.2 大鼠血液各項指標的檢測取大鼠腹主動脈血后，加抗凝劑的全血采用全自動血液分析儀檢測 白 細 胞 （white blood cell，WBC）、 血 紅 蛋 白（hemoglobin，HGB）、紅細胞（red blood cell，RBC）和紅細胞壓積（hematocrit，HCT）。 腹主動脈血分離得到血清，采用試劑盒檢測血清鐵（serum iron，SI）及血清鐵蛋白（serum ferritin，SF）。

1.6 數據統計與處理

使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行數據分析，各組數據以平均值±標準差的形式表示， 各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 牛血肽對大鼠體質量的影響

消瘦是IDA 的典型癥狀之一，與人IDA 癥狀一致，實驗中IDA 大鼠的體質量明顯低于對照飼料組大鼠，見表1。為了評價含鐵牛血肽對貧血大鼠體質量的影響，每周對大鼠體質量進行測量，觀察大鼠體質量變化。

表1 牛血肽對大鼠體質量的影響Table 1 Effect of bovine blood peptide on body weight of rats

對照飼料組大鼠體質量平均增長99.57 g，而空白對照組大鼠體質量平均增長僅46.87 g，與對照飼料組差異顯著（P＜0.05）； 各血肽組和生血寧組大鼠體 質 量 平 均 增 長 分 別 為78.38、111.40、104.20、106.37 g，都明顯高于空白對照組（P＜0.05），與對照飼料組相比均無顯著差異（P＞0.05），說明血肽可以有效改善IDA 對于大鼠體質量增加的影響。 進一步比較低劑量和中高劑量組，可見隨著血肽劑量的增加，大鼠體質量增長幅度呈加大趨勢， 但是中高劑量組差別不大，說明中劑量組效果達到峰值，是最優劑量。

2.2 牛血肽對大鼠白細胞數量的影響

文獻報道，IDA 會導致大鼠白細胞數量上升，這可能與貧血導致的缺氧有關[15]。當機體缺氧時，會引起炎性反應性變化，促進中性粒細胞的分化、成熟及存活。 為了觀察血肽的抗貧血作用，檢測了大鼠外周血白細胞數量。

血常規結果顯示，IDA 大鼠的外周血白細胞數量約為正常對照大鼠的2 倍，而血肽與生血寧均可顯著性改IDA 導致的白細胞增多（P＜0.01）。 治療后白細胞水平與正常對照組相比無明顯差異 （P＞0.05）。血肽高中低劑量組白細胞數量均接近或略低于正常對照組，見表2。

表2 牛血肽對大鼠白細胞的影響Table 2 Effects of bovine blood peptide on rat leukocytes

2.3 牛血肽對大鼠血紅蛋白水平和紅細胞數量的影響

血紅蛋白由珠蛋白與血紅素組成，其中血紅素是鐵與卟啉形成的金屬卟啉配合物[16]，因此鐵是合成血紅蛋白的重要原料， 而血紅蛋白含量是評價IDA 療效的一項重要指標。 缺鐵導致的血紅蛋白降低會引起紅細胞生成減少，因此，反映紅細胞數量的2 個參數，即紅細胞計數與紅細胞壓積也是檢驗IDA 療效的主要指標[17]。 牛血肽由牛血細胞經蛋白酶水解制成，其中富含的鐵元素主要以血紅素鐵的形式存在。為了評價含血紅素鐵牛血肽對IDA 大鼠血紅蛋白水平和紅細胞數量的影響，檢測了治療后各組大鼠HGB、RBC 和HCT 水平。

由表3 可知， 經過血肽和生血寧治療后，HGB水平上升，與空白對照組相比差異顯著（P＜0.05）。隨著血肽劑量增加，HGB 水平呈上升趨勢， 說明血肽有效改善貧血并呈現劑量依賴效應。 實驗終止時各治療組HGB 水平仍低于對照飼料組， 其原因可能是治療時間短，貧血尚未完全糾正。

表3 牛血肽對大鼠紅細胞的影響Table 3 Effects of bovine blood peptide on red blood cell in rats

IDA 模型組大鼠RBC 和HCT 明顯低于對照飼料組。 經治療，血肽組與生血寧組RBC 及HCT 水平上升，與空白對照組相比有顯著差異（P＜0.05），說明血肽與生血寧均可有效改善IDA 大鼠RBC 以及HCT 的下降。 血肽中、高劑量組RBC 數量接近，且明顯高于生血寧組，提示中高劑量牛血肽促進RBC生成效果強于生血寧。在改善HCT 指標上，血肽中、高劑量組也比生血寧組的效果更好。 以上結果表明含鐵牛血肽促進紅細胞生成，且中劑量牛血肽效果最好。

2.4 牛血肽對大鼠血清鐵代謝的影響

食物中的鐵在十二指腸被吸收后進入血液循環，稱為血清鐵，再通過與轉鐵蛋白結合被運輸到骨髓用于造血。 血清鐵蛋白是體內儲藏鐵的主要載體，可釋放鐵離子來保障骨髓造血等鐵元素參與的生命活動過程[18]。SI 和SF 是反映鐵代謝的常用生化指標， 對于IDA 的診斷和治療效果評價具有重要價值[19-21]。

治療后大鼠SI 與SF 檢測結果顯示，SI 和SF均得到了改善，見表4。 血肽中、高劑量組的SI 與SF水平與對照飼料組相比均無顯著差異（P＞0.05），且與空白對照組相比差異顯著（P＜0.05），說明含鐵牛血肽可改善IDA 大鼠的低鐵狀態， 增加體內鐵存儲。 與空白對照組相比，血肽低劑量組與生血寧組SI 和SF 有所增加，但是無顯著差異（P＞0.05）。 因此，中、高劑量含鐵牛血肽改善大鼠SI 和SF 的效果更好。

表4 牛血肽對大鼠血清鐵代謝的影響Table 4 Effect of bovine blood peptide on serum iron metabolism in rats

2.5 牛血肽對大鼠胃的影響

貧血會導致皮膚黏膜蒼白，而常見的口服鐵劑對胃腸道黏膜有一定的刺激，容易引起消化不良等副作用[22]。 在評價藥物對IDA 治療效果時，對于胃的觀察必不可少。 治療結束后，取大鼠胃部，沿胃大彎縱向切開，觀察胃黏膜變化。

如圖1 所示， 與對照飼料組大鼠胃黏膜相比，空白對照組大鼠胃黏膜顏色蒼白， 符合貧血特征。血肽組與生血寧組大鼠的胃黏膜表面紅潤且沒有出現充血、水腫、潰瘍等損傷，說明在治療過程中，含鐵牛血肽與生血寧不但未對大鼠胃黏膜造成明顯損害而且顯著改善了胃黏膜色澤。

圖1 不同組大鼠胃解剖圖Fig.1 Gastric anatomy of rats in different groups

3 結 語

牛血作為原料被用于生產血球蛋白粉、血漿蛋白粉等動物性蛋白飼料，在飼料工業中得到了廣泛應用并且取得了較好效益[23]。 從牛血中還可提取血紅素來制備氯化血紅素[24]，用于預防和治療IDA[25]。 開發利用牛血肽是加工牛血的一條新途徑，將提高牛血的利用率和經濟價值，具有很好的市場前景。

目前臨床上常用的口服補鐵劑如硫酸亞鐵等屬于無機鐵，容易刺激胃腸道，在服用過程中可能出現惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應[26]。 而本研究采用的牛血肽所含鐵為血紅素鐵，對胃腸道刺激小。 血紅素鐵以卟啉鐵的形式存在，比無機鐵更容易被十二指腸上皮細胞吸收[27]，生物利用率也更高[28-29]。 有文獻報道血紅素鐵治療IDA 的效果比非血紅素鐵更優[30]。

本研究用的陽性對照藥物生血寧是一種治療貧血的中藥，在治療IDA 方面具有較好的臨床效果和安全性[31-32]。 生血寧主要成分為蠶沙提取物，含有鐵葉綠酸鈉和葉綠素衍生物，是一種有機卟啉鐵[33]，因此在本研究中被用作陽性對照。 本研究中大鼠的生血寧給藥劑量是按照藥品說明書規定的成人用藥量換算得到。

紅細胞生成的調節機制是促紅細胞生成素與促紅細胞生成素受體結合并激活下游信號通路，進而促進紅細胞增殖與成熟[34]。根據這一機制，有研究人員設計合成出多種不同促紅細胞生成素模擬肽，都顯著提升了RBC 數量與HGB 含量[35-36]。 在本研究中， 中高劑量牛血肽組在改善RBC 與HGB 水平上效果優于低劑量組和生血寧組，這提示除了補鐵作用，含鐵牛血肽的某些肽類物質可能促進了紅細胞增殖與血紅蛋白的合成，具體是由哪種氨基酸序列的多肽起到關鍵性作用則需進一步研究。

采用灌胃方法給予IDA 大鼠含鐵牛血肽治療，有效緩解了因貧血導致的低體質量和黏膜蒼白癥狀，恢復了血常規、血清鐵等血液指標，并且未見損傷大鼠的消化道黏膜。含鐵牛血肽對大鼠IDA 治療是有效的，開發富含血紅素鐵的牛血肽治療IDA，值得應用與推廣。