魔芋葡甘聚糖對人結腸細胞株基因組穩定性的影響

李 翔， 曹 宇， 唐湘華， 汪 旭,3， 倪 娟*

（1.云南師范大學 生命科學學院， 云南 昆明 650500；2.云南師范大學 生物能源持續開發與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500；3.臺州耶大基因與細胞治療研究中心，浙江 臺州 318000）

魔芋（konjac）是多年生天南星科草本植物的地下塊莖。 魔芋葡甘聚糖（konjac gluconnan，KGM）是魔芋塊莖中的水溶性膳食纖維，為一種高相對分子質量非離子型雜多糖，具有水溶性、成膜性、持水性、膠黏性、增稠性、衍生性、配伍性等多重優良特性和特殊的生物活性[1-3]。 KGM 具有降低膽固醇、預防高血壓、高血脂、糖尿病等多種生理功效[4-5]。

腸道是人體最大的消化和排泄器官[6]，腸黏膜上皮細胞通過相互連接，形成了一個完整的生物屏障（腸上皮細胞屏障），在維護腸道健康中發揮重要作用[7]。 基因組穩定性是維護細胞生理穩態的重要基礎，基因組穩定性下降是眾多癌細胞的特征之一[8]。少量的基因組不穩定性（genome instability，GIN）可誘發細胞周期停滯，細胞將啟動相應機制修復受損基因組；若細胞出現過高且不可逆的GIN 時，細胞的生存將受到威脅，通過各種死亡途徑被清除[9]。 在消化道中，若腸道細胞GIN 增加，腸道細胞將出現生存劣勢，進而使腸道屏障功能發生異常，引發生化級聯反應，導致腸內慢性炎癥及多種腸道疾病如炎癥性腸病、腸易激綜合征，以及一部分腸外慢性炎癥的發生。 若機體長期處于炎癥微環境中，DNA將會受到持續的氧化脅迫及炎癥因子的干擾，再次增加其損傷概率， 導致GIN 的發生頻率顯著增加，細胞程序性死亡過程終止，增大細胞惡性轉化及形成腫瘤細胞的可能[10]。

許多研究表明，植物多糖能夠有效地抑制癌癥的發生發展[11]，植物多糖可通過調控細胞周期、誘導凋亡、干擾能量代謝、調控信號通路等生物學過程抑制或延緩癌細胞的增殖過程。 例如，蒲公英多糖在體內可促進P53 和Bax 的表達，并抑制Bcl-2 的表達，從而誘導乳腺癌細胞凋亡，發揮其抗乳腺癌作用[12]；綠茶中的茶多糖可以降低結腸癌細胞周期蛋白cyclin D1 的表達[13]，阻止腫瘤細胞由G1 期進入S 期，使癌細胞的分裂及增殖受到干擾；Wu 等人用裙帶菜多糖處理乳腺癌MCF-7 細胞， 觀察到裙帶菜多糖可以阻滯細胞S 期[14]。已有研究表明，KGM對維護腸道屏障具有積極的生理效應，能有效保護胃黏膜，清潔胃壁，還具有良好的腸道益生性[15-16]。流行病學實驗表明，KGM 對預防結腸癌具有一定的積極效應[17-19]，其可能通過影響細胞因子如IL-1β、TNF-α 和IFN-γ 等的表達發揮抗腫瘤作用。作者研究了KGM 對不同類型腸道細胞的GIN 的影響，以及對不同類型細胞的生長狀況產生差異的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常結腸上皮細胞NCM460、 人結腸癌細胞SW620、HCT116 細胞：中國科學院細胞庫；二甲基亞砜：Biosharp 公司；細胞松弛素B（cytochalasin b，CB）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、青/鏈霉素溶液、L-谷氨酰胺、 新生牛血清、RPMI-1640 培養基：Gibco 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）：美國Sigma 公司；臺盼蘭染液：Solarbio 公司；吉姆薩粉末：上海三思爾公司；KGM： 由作者所在生物能源持續開發利用教育部工程研究中心提供。

1.2 主要儀器與設備

超凈工作臺SW-CJ-2FD 型： 蘇州安泰空氣技術有限公司；二氧化碳培養箱MCO-15AC 型：日本三洋；細胞涂布離心機TXD3 型：湖南湘儀離心機儀器有限公司； 光學顯微鏡VANOX-S 型： 日本Olympus；酶標儀SpectraMax iD3 型：美谷儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS 型：上海申安醫療器械廠。

1.3 細胞培養

NCM460、SW620 及HCT116 細 胞 株 分 別 培 養于含有體積分數10%新生牛血清、 體積分數1%谷氨酰胺（L-glutamine，L-Glu）、體積分數0.1%青霉素/鏈霉素溶液的RPMI-1640 完全培養基中， 并置于培養箱內靜置培養，培養箱內CO2體積分數為5%，溫度為37 ℃，每2～3 d 更換一次培養基，待細胞鋪滿75%～90%瓶底面積時進行細胞計數并傳代。

1.4 細胞活力檢測

1.4.1 KGM 儲備液配制稱取2.4 g KGM 溶于10 mL 蒸餾水中，配置成240 mg/mL 的儲備液。

1.4.2 加藥處理將NCM460、SW620 及HCT116細胞以每孔4×105個/mL 接種至細胞培養96 孔板中，于37 ℃、體積分數5%的CO2條件下培養，待細胞貼壁后， 每孔加入預設質量濃度（0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mg/mL） 的KGM 分別處理24、48、72 h。

1.4.3 MTT 法檢測細胞活力經加藥處理后，每孔加入四甲基噻唑藍（tetramethylthiazole blue，MTT）20 μL 繼續培養4 h 后終止培養。 吸棄每孔液體，加入150 μL DMSO 后置搖床上緩慢搖勻10 min。待結晶物充分溶解后， 用酶標儀在490 nm 波長處測定吸光度，繪制生長曲線[20]。

式中：I 為細胞存活率，%；OD實驗組為實驗組在490 nm 處吸光度；OD對照組為對照組在490 nm 處的吸光度。

1.5 胞質阻斷分裂微核分析細胞組實驗 （CBMNCyt）

將NCM460、SW620 及HCT116 分 別 以3×105個/mL 接種到細胞培養6 孔板中，于37 ℃、體積分數5%的CO2條件下培養， 待細胞貼壁后， 加入KGM（0、5、20、30 mg/mL），72 h 后棄含KGM 的培養基，用含有CB（終質量濃度為3 μg/mL）的培養基繼續培養，24～28 h 后收集細胞。 經涂片、固定、染色、封片后，分別按計數標準統計單核、雙核細胞中的微核、多核、核質橋、核芽、凋亡等指標，計算不同質量濃度KGM 處理后3 種受試細胞的GIN、 核分裂指數（nuclear division index，NDI）和凋亡率，見圖1。

圖1 CBMN-Cyt 實驗中各種指標的示意圖Fig.1 Representative images of various indicators in the CBMN-Cyt experiment

1.6 統計分析

實驗數據用SPSS 25.0 進行統計學分析，用one-way ANOVA 進行組件比較， 所有數據均用平均數±標準誤表示；用GraphPad Prism 8.0.2 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 KGM 對結腸上皮細胞活力的影響

經不同質量濃度KGM 處理NCM460、SW620、HCT116 細 胞24、48、72 h 后，MTT 法 檢 測 細 胞 活力， 結果見圖2～4。 5～40 mg/mL 的KGM 處理24、48、72 h， 顯著提高了NCM460 細胞的活力 （P＜0.05）， 見圖2。 經5～40 mg/mL KGM 處理24 h 后，SW620 和HCT116 細胞活力顯著提高（P＜0.05）；處理48 h 后，SW620 細胞活力無顯著變化（P＞0.05），HCT116 細胞在10～40 mg/mL 處理后細胞的活力顯著提高（P＜0.05）。 隨著處理時間和KGM 質量濃度的增加，2 株癌細胞SW116 和SW620 的細胞活力顯著被抑制。 當處理72 h 后，在KGM 質量濃度達40 mg/mL 時，極顯著降低了2 株癌細胞的細胞活力并且致死率達54.5%和41.5%，表明KGM 可抑制結腸癌細胞增殖，見圖3～4。 根據細胞活力數據顯示，將后續實驗的最高質量濃度設置為HCT116 半致死質量濃度的80%，即30 mg/mL，處理時間為72 h。

圖2 不同質量濃度KGM 處理24、48、72 h 對NCM460 細胞活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of KGM on the viability of NCM460 cells treated for 24，48 and 72 h

圖3 不同質量濃度KGM 處理24、48、72 h 對SW620細胞活力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of KGM on the viability of SW620 cells treated for 24，48 and 72 h

圖4 不同質量濃度KCM 處理24、48、72 h 對HCT116 細胞活力的影響Fig.4 Effects of different concentrations of KGM on the viability of HCT116 cells treated for 24，48 and 72 h

2.2 KGM 對結腸上皮細胞基因組不穩定性及凋亡的影響

2.2.1 不同質量濃度KGM 對NCM460 GIN、NDI 以及細胞凋亡發生頻率的影響CBMN-Cyt 實驗結果顯示，KGM 處理NCM460 細胞72 h 后，5～20 mg/mL的KGM 可極顯著降低其微核發生頻率 （P＜0.01），KGM 為20～30 mg/mL 時核質橋發生頻率顯著上升（P＜0.05），核芽發生頻率無顯著變化，見圖5（a）；中低質量濃度（5～20 mg/mL）的KGM 則降低了GIN 水平和細胞凋亡率，對正常腸道細胞的健康表現出維護效應； 但高質量濃度 （30 mg/mL） 的KGM 處理NCM460 細胞72 h 后其GIN 顯著升高，提示高質量濃度KGM 會誘發正常結腸細胞基因組不穩定性，見圖5（b）。 這與郭偉等[21]的動物模型研究結果一致，即高質量濃度KGM 不利于腸道健康；不同質量濃度KGM 對細胞的NDI 發生頻率無顯著影響，見圖5（c）；隨著KGM 質量濃度的升高，細胞凋亡率逐漸降低，見圖5（d）。 30 mg/mL 的KGM 極顯著降低NCM460 的凋亡率（P＜0.001）。

圖5 不同質量濃度KGM 處理72 h 對NCM460 細胞凋亡、NDI 和GIN 的影響Fig.5 Effects of different concentrations of KGM on apoptosis，NDI，and GIN of NCM460 cell treated for 72 h

2.2.2 不同質量濃度KGM 對SW620 GIN、NDI 以及細胞凋亡發生頻率的影響KGM 處理72 h 后，質量濃度為5～30 mg/mL 時極顯著增加了SW620 細胞微核、核芽的發生頻率（P＜0.001），核質橋發生頻率無顯著變化，見圖6（a）；KGM 質量濃度為5～30 mg/mL 時，GIN 發生頻率顯著增加 （P＜0.05）。KGM 在20～30 mg/mL 時，GIN 發生頻率增加極顯著（P＜0.001），見圖6（b）；NDI 發生頻率隨KGM 質量濃度的增加呈極顯著降低趨勢，P＜0.001；KGM 在20～30 mg/mL 時細胞凋亡發生率極顯著增加 （圖6（d），P＜0.001）。

圖6 不同質量濃度KGM 處理72 h 對SW620 細胞凋亡、NDI 和GIN 的影響Fig.6 Effects of different concentrations of KGM on apoptosis，NDI，and GIN of SW620 cell treated for 72 h

2.2.3 不同質量濃度KGM 對HCT116 GIN、NDI 以及細胞凋亡發生頻率的影響處理72 h 后，質量濃度為5 mg/mL 的KGM 極顯著增加了HCT116 細胞微核發生頻率（P＜0.01），質量濃度20 mg/mL 的KGM顯著增加其微核發生頻率（P＜0.05），見圖7（a）；KGM 質量濃度在20 mg/mL 時核質橋發生頻率極顯著增加（P＜0.05），KGM 質量濃度在5、30 mg/mL 時核芽發生頻率極顯著增加（P＜0.05）；KGM 質量濃度在5～30 mg/mL 時GIN 發生頻率極顯著增加（P＜0.001），見圖7（b）；KGM 質量濃度在5 mg/mL 和30 mg/mL 時NDI 發生頻率顯著降低（P＜0.05），見圖7（c）； 在KGM 質量濃度為5～30 mg/mL 時細胞凋亡發生率極顯著增加（P＜0.001），見圖7（d）。

圖7 不同質量濃度KGM 處理72 h 對HCT116 細胞凋亡、NDI 和GIN 的影響Fig.7 Effects of different concentrations of KGM on apoptosis，NDI and GIN of HCT116 cell treated for 72 h

3 結 語

目前，已有研究證明KGM 對腸道健康有益，其作為一種優質的益生元， 可促進腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌的生長[22-23]，可使受損的黏膜屏障功能恢復，起到調節腸道微生物群穩態、抑制病原菌大量繁殖、增強腸道免疫的作用，對腸道疾病的緩解起到積極作用[24-25]。 本研究顯示，在正常結腸上皮細胞NCM460 中，中低質量濃度（5～20 mg/mL）的KGM 降低了GIN 水平和細胞凋亡率， 對正常腸道細胞的健康表現出維護效應。 但高質量濃度（30 mg/mL） 的KGM 處理NCM460 細胞72 h 后使其GIN 顯著升高，這與黃夏伶等研究結果一致[26]。在高劑量葡甘聚糖處理后的老年小鼠中，易見結腸炎性細胞聚集以及小腸完整結構破壞，即高劑量的KGM造成腸道細胞生成劣勢，這可能是大多數腸道動力不足的老年人過量食用葡甘聚糖后排便困難的重要原因之一。質量濃度為5～30 mg/mL 的KGM 能夠顯著誘發SW620 和HCT116 細胞高水平GIN，并降低2 株結腸癌細胞的NDI，使細胞凋亡率顯著升高。KGM 在正常細胞和癌細胞中表現出不同的效應，即在正常細胞中可維護基因組穩定性，而在癌細胞中則誘發基因組不穩定性， 這可能是其維護腸道健康的分子基礎。 結果顯示， 高質量濃度（30 mg/mL）的KGM 處理NCM460 細胞72 h 后可使其GIN 顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，這與目前對GIN 與細胞凋亡相互關系的研究結論存在差距。 其原因可能是細胞凋亡率與KGM 質量濃度之間存在時間上的滯后，后期將適量增加KGM 的質量濃度再次驗證。 本研究僅在離體條件下從基因組穩定性水平考查了KGM 對不同病理狀態的腸上皮細胞的影響，對于其作用機理還有待從活體及分子水平更進一步深入研究。