高效液相色譜法測(cè)定萬(wàn)古霉素血藥濃度的分析與研究

蘇洪濤,藍(lán) 妮

(廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福建 廈門(mén) 361000)

萬(wàn)古霉素是一種廣譜抗生素,常用于治療多種感染疾病,為了確保該藥物的療效和安全性,需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)[1]。HPLC被廣泛應(yīng)用于萬(wàn)古霉素血藥濃度的分析與研究[2]。HPLC是一種常用的分離和定量分析技術(shù),HPLC基本原理是將待測(cè)樣品通過(guò)一個(gè)固定填充物的柱子進(jìn)行分離。樣品溶解于流動(dòng)相中,并由一液體泵推動(dòng)流經(jīng)柱子的流動(dòng)相。在柱子內(nèi)部存在著一種固定的填充物,稱(chēng)為固定相[3]。樣品中的組分會(huì)根據(jù)其與固定相的親疏水性質(zhì)的不同以及其他化學(xué)相互作用的差異,在流動(dòng)相的作用下分離出來(lái)。分離出的各個(gè)組分可通過(guò)檢測(cè)器進(jìn)行監(jiān)測(cè)和定量。HPLC中的流動(dòng)相通常為有機(jī)溶劑和水的混合物,根據(jù)樣品的性質(zhì)和分離要求進(jìn)行選擇和調(diào)節(jié),流動(dòng)相的選擇對(duì)分離效果和分析速度有重要影響[4]。進(jìn)樣器用于將待測(cè)樣品精確地引入流動(dòng)相中,常見(jiàn)的進(jìn)樣方式包括手動(dòng)進(jìn)樣和自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)。柱子是HPLC的核心組件,也稱(chēng)為色譜柱或固定相柱,柱子內(nèi)部填充有具有特定吸附性質(zhì)的顆粒狀材料,如硅膠、碳?xì)浠衔铩⒎聪嗖牧系?不同的柱子和填充物適用于不同的分離類(lèi)型。檢測(cè)器用于檢測(cè)樣品在柱子中分離過(guò)程中的化學(xué)或物理性質(zhì)的變化,常見(jiàn)的檢測(cè)器包括紫外-可見(jiàn)光譜檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等[5]。數(shù)據(jù)系統(tǒng)用于采集、處理和分析檢測(cè)器得到的數(shù)據(jù),通過(guò)數(shù)據(jù)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)峰面積的計(jì)算、峰識(shí)別和結(jié)果輸出等功能。HPLC技術(shù)具有高分辨率、高靈敏度、高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn),能夠同時(shí)分析多種組分,且可用于定量分析和結(jié)構(gòu)鑒定[6]。本文采用去甲基萬(wàn)古霉素作為內(nèi)標(biāo),對(duì)萬(wàn)古霉素血藥濃度進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

島津高效液相色譜儀:LC-20AB泵,SIL-20A型全自動(dòng)進(jìn)樣器,CTO-20A型色譜柱,SPD-20AV型紫外線(xiàn)檢測(cè)器,DGU-20A3型在線(xiàn)脫氣裝置,LC-解決方案工作站;Millipore Simplicity純水儀;Eppendorff Centrifuge 5804R低溫高速離心機(jī);AL 104-IC電子天平;XH-B型漩渦混合器。

萬(wàn)古霉素對(duì)照品,去甲萬(wàn)古霉素對(duì)照品,色譜純?yōu)橐译?分析純?yōu)榱姿岫溻浖傲姿?水為Millipore水儀制得的超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱:依利特Hypersil BDSC8(4.6mm×250mm,5μm),40℃柱溫;流動(dòng)相:20 mmol磷酸二氫鉀,pH值調(diào)節(jié)到3.1;采用梯度洗脫,條件如下:0～6.5min,B為乙腈,從10%下降到5%;6.5～6.51 min,B為50%;10.0～10.01min,B由5%上升到10%,10.01～17.5 min,B為10%。流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm;進(jìn)樣量20μL內(nèi)標(biāo)法定量。

1.2.2 流動(dòng)相的配制

精確稱(chēng)取1.361 g磷酸二氫鉀,將其溶于500 mL超純水中,再添加100 μL磷酸,在溶解和均勻混合之后,用0.45μm的水相濾膜進(jìn)行過(guò)濾,得到pH為3.1的20 mmol/L的磷酸二氫鉀溶液。

1.2.3 儲(chǔ)備液的配制

對(duì)照品儲(chǔ)備液:取10 mL容量瓶,準(zhǔn)確稱(chēng)量適當(dāng)數(shù)量的萬(wàn)古霉素參照物,以超純水溶解,定容后得萬(wàn)古霉素參照物1.05 mg/mL;將1mL的溶液置于10mL的容量瓶?jī)?nèi),用超純水稀釋至刻度后,經(jīng)充分?jǐn)嚢韬?得105mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4℃冷藏保存。

內(nèi)標(biāo)工作液:精確稱(chēng)取去甲萬(wàn)古霉素對(duì)照品適量,將其放入25 mL的容量瓶中,以超純水溶于定容,攪拌均勻,制成200 mg/L的內(nèi)標(biāo)液。并在4℃下冷藏。

1.2.4 血樣處理

取血漿樣品0.4 mL,放入2.0 mL的離心管內(nèi),加入25 μL的內(nèi)標(biāo)液,攪拌均勻后,加入乙腈0.8 mL,漩渦振動(dòng)3min,14000 r/min的離心8min,再將1 mL的上清液放入玻璃試管,再加二氯甲烷3 mL,漩渦振動(dòng)3min,3000 r/min的離心6min,再將20 mL的上清液放入樣品。定量采用內(nèi)標(biāo)法。

2 結(jié)果

2.1 線(xiàn)性關(guān)系考察

取一份空白血漿,并精確地添加不同量的萬(wàn)古霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液,使血漿中的藥物濃度分別為1.313、2.625、5.25、10.5、26.25、52.5、105 mg/L,按照血樣進(jìn)行處理,以被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y對(duì)X(mg/L)進(jìn)行線(xiàn)性回歸,權(quán)重為1/X。得回歸方程為:Y=0.0620X+0.1020,r=0.9990。本實(shí)驗(yàn)的線(xiàn)性范圍為1.310～105.00 mg/L,最低檢測(cè)濃度(S/N≥3)為0.658 mg/L。

2.2 方法的專(zhuān)屬性考察

采用不同的樣品前處理方式及層析分離條件,分別測(cè)定了空白血漿、內(nèi)標(biāo)物及對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的層析圖譜。在萬(wàn)古霉素的出峰位置,去甲萬(wàn)古素的出峰位置,沒(méi)有顯著雜質(zhì)干擾,內(nèi)標(biāo)萬(wàn)古霉素保留時(shí)間為4.65min,去甲萬(wàn)古素的保留時(shí)間為5.55min。

2.3 回收率試驗(yàn)

絕對(duì)回收率:精密抽取對(duì)照品儲(chǔ)備液,配制出濃度為5.25、26.25、78.75 mg/L的含藥血漿各5份,按照血樣進(jìn)行處理進(jìn)樣,將兩者峰面積進(jìn)行記錄,并將其與相應(yīng)濃度對(duì)照品峰面積進(jìn)行對(duì)比,得出絕對(duì)回收率,3種濃度血漿樣品的絕對(duì)回收率(n=5)分別為66.58%、70.51%、69.79%,去甲萬(wàn)古的回收率(n=5)為73.88%。

方法回收率:將三種濃度分別配制成5.25、26.25、78.75 mg/L的含藥血漿,每一種濃度分別為5份,將其作為血液樣品進(jìn)行處理,然后進(jìn)樣,對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)其進(jìn)行計(jì)算,從而計(jì)算出檢出量與添加量的比值,從而得到方法的回收率。見(jiàn)表1。

表1 相對(duì)回收率與精密度

2.4 精密度試驗(yàn)

配制出5.25、26.25、78.75 mg/L三種濃度的含藥血漿,各5份,將其作為血液樣品進(jìn)行處理,在同一天進(jìn)行測(cè)量,并連續(xù)測(cè)量4天,計(jì)算出日內(nèi)和日間的精密度。見(jiàn)表1。

3 討論

萬(wàn)古霉素是一種廣譜抗生素,屬于糖肽類(lèi)抗生素,它是一種通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成而發(fā)揮作用的藥物[7]。萬(wàn)古霉素主要用于治療由對(duì)其他抗生素耐藥的細(xì)菌引起的感染,萬(wàn)古霉素可通過(guò)靜脈注射或靜脈滴注進(jìn)行給藥,通常在醫(yī)院的嚴(yán)密監(jiān)測(cè)下使用[8]。萬(wàn)古霉素的副作用相對(duì)較少,但仍可能出現(xiàn)一些不良反應(yīng),包括過(guò)敏反應(yīng)、紅斑性瘙癢病、腎功能損傷等。此外,長(zhǎng)期使用萬(wàn)古霉素可能導(dǎo)致腸道菌群失調(diào),增加耐藥菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。在使用萬(wàn)古霉素之前,應(yīng)該先進(jìn)行細(xì)菌敏感性測(cè)試,以確定細(xì)菌對(duì)該藥物的敏感性,此外,患者需要定期進(jìn)行肝功能和腎功能的監(jiān)測(cè),以確保安全使用。HPLC是一種精準(zhǔn)、靈敏且可靠的分析技術(shù),常用于藥物血藥濃度的測(cè)定,在萬(wàn)古霉素的分析中,HPLC能夠有效地分離和定量目標(biāo)藥物,并且具有較高的分析速度和準(zhǔn)確性[9]。在進(jìn)行萬(wàn)古霉素血藥濃度的HPLC分析之前,需要對(duì)血液樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹苽?通常采用蛋白沉淀、提取等方法將萬(wàn)古霉素從血液中分離出來(lái),然后使用合適的溶劑進(jìn)行稀釋和洗脫以得到待測(cè)樣品。為了實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的血藥濃度測(cè)定,需要建立萬(wàn)古霉素的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線(xiàn),繪制得到校準(zhǔn)曲線(xiàn),并根據(jù)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中萬(wàn)古霉素的濃度[10]。此外,還需要在分析過(guò)程中加入質(zhì)控樣品進(jìn)行質(zhì)量控制,以確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

HPLC可以檢測(cè)非常低的濃度,能夠確定萬(wàn)古霉素在血液中的濃度;HPLC能夠通過(guò)優(yōu)化分離柱和流動(dòng)相的條件,實(shí)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素與其他組分的有效分離,從而避免干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響;HPLC具有良好的定量能力和可重復(fù)性,能夠提供準(zhǔn)確的萬(wàn)古霉素濃度數(shù)據(jù);HPLC是一種高效的分析方法,能夠在較短的時(shí)間內(nèi)完成樣品的分離和測(cè)定,提高工作效率;HPLC可以根據(jù)需要選擇不同類(lèi)型的柱和檢測(cè)方式,適應(yīng)不同樣品類(lèi)型和分析要求,使其具有很大的靈活性[11-12]。綜上所述,HPLC作為一種高靈敏度、高選擇性、高精確度和重復(fù)性的分析技術(shù),是測(cè)定萬(wàn)古霉素血藥濃度的理想方法之一。本文研究結(jié)果顯示,本測(cè)定法在1.310～105.00 mg/L有較好線(xiàn)性關(guān)系(r=0.9990),日內(nèi)、日間精密度均≤5.21%,絕對(duì)回收率>66%。

綜上所述,HPLC法檢測(cè)血液中萬(wàn)古霉素的含量,具有快速、可靠、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。